(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(45) 공고일자 2007년10월04일
(11) 등록번호 10-0761869
(24) 등록일자 2007년09월19일
(51) Int. Cl.

C07D 251/18(2006.01) C07D 401/12 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2006-0064059
(22) 출원일자 2006년07월07일
심사청구일자 2006년07월07일
(56) 선행기술조사문헌
J. Comb. Chem. 2004, 6, 862-868
(뒷면에 계속)
(73) 특허권자
김현기
서울 강남구 압구정동 434 현대아파트 118-804
(72) 발명자
김현기
서울 강남구 압구정동 434 현대아파트 118-804
김진우
서울 강남구 압구정동 434 현대아파트 118-804
(74) 대리인
남호현
전체 청구항 수 : 총 6 항 심사관 : 이민정
(54) 트리아진 유도체 화합물 및 이를 포함하는 암 치료용조성물
(57) 요 약
본 발명은 특정 화학식을 가진 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염과 이를 포함하는 약학
조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 또는 조성물은 암을 치료하는데 유용하며, 특히 유방암 치료에 탁월한
효능을 가진다.
대표도 - 도7
- 1 -
등록특허 10-0761869
(56) 선행기술조사문헌
J. Am. Chem. Soc. 2002, 124(39), 11608-11609
KR1020010032998 A
KR1020020058043 A
US6943162 B2
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등록특허 10-0761869
특허청구의 범위
청구항 1
하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:
<화학식 1>
상기 화학식 1에서, R1은 탄소수 1 내지 8의 직쇄상(linear) 또는 분지상(branched) 알킬이며, R2는 탄소수 1
내지 8의 직쇄상 또는 분지상 알킬, 알릴(allyl), 피리디닐메틸(pyridinylmethyl), 피리디닐에틸 및 피리디닐프
로필로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, R3는 치환되지 않은 벤조일(benzyol) 또는 탄소수 1 내지 3
의 알킬로 치환된 벤조일이고, n은 1 내지 3의 정수임.
청구항 2
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1은 부틸이며, R2는 알릴, 1-에틸프로필 및 피리디닐메틸로 이루어진 군으로
부터 선택된 어느 하나이고, R3는 치환되지 않은 벤조일(benzyol)이며, n은 2인 것을 특징으로 하는 트리아진
유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
청구항 3
제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 R2는 알릴인 것을 특징으로 하는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로
허용가능한 염.
청구항 4
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것
을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
청구항 5
제4항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 신장암, 뇌암, 난소암, 위암, 자궁경부암, 폐암, 백혈병, 림프종,
간암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
청구항 6
제5항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
명 세 서
발명의 상세한 설명
발명의 목적
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등록특허 10-0761869
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
본 발명은 암, 특히 유방암을 치료하는데 유용한 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 치료방<12>
법에 관한 것이다.
최근 국내 보도자료에 의하면, 암을 비롯하여 고혈압, 뇌혈관 질환, 당뇨병 등과 같은 만성질환의 발병률이 계<13>
속 증가하고 있으며, 이러한 질병으로 인한 경제적 손실은 약 37조 원에 이른다고 분석하고 있다. 특히, 우리나
라에서 질병으로 인한 사망률 1위가 암이며, 암으로부터의 고통은 경제적 비용뿐만 아니라 정신적인 손실에도
막대한 영향을 끼친다. 그러나, 암 치료법의 진전으로 암으로 인한 사망자 수는 꾸준히 감소하고 있으나 암 환
자 수 자체의 지속적인 증가 및 치료 약물의 투여 기간이 장기화되고 있다.
한편 유방암은 유방에 생기는 암으로 유방에 있는 많은 종류의 세포 중 어느 것이라도 암이 될 수 있으므로 유<14>
방암의 종류는 매우 많다고 할 수 있지만, 대부분의 유방암이 유관과 유엽에 있는 세포 그 중에서도 유관세포에
서 기원하므로 일반적으로 유방암이라 하면 유관과 유엽의 상피세포에서 기원한 암을 말한다. 유방암은 암 중에
서 연구가 가장 많이 된 암종 중 하나인데도 아직 확실하게 유방암의 발생기전으로 밝혀진 것은 없다.
한국에서 유방암은 전체 암에서 위암, 폐암, 간암, 대장암에 이어서 다섯 번째로 2000년에는 전체 암 발생의　<15>
6.5%(5,444명)이고 여성의 악성 종양 중에서 위암에 이어 두 번째로 흔한 암이었으나, 2002년에는 전체 암 발생
의　7.4%(7,359명)로 위암을 제치고 여성의 악성 종양 중 1위(16.8%)를 차지하였다(국립암센터 2005년
자료보고). 한편, 유방암은 여성에게서만 발생하는 것은 아니어서 남성도 유방암에 걸릴 수 있으나 발생 비율이
여성의 1/100 미만이다.
현재의 항암요법 중, 화학요법을 이용한 항암제가 전체에서 약 30% 정도를 차지하고 있으며, 그의 일례로서, 전<16>
립선암에 루프론, 난소암에 탁솔, 유방암에 졸라덱스 등을 비롯한 40-50 여종이 임상에서 사용되고 있으며, 이
외의 여러 화학요법제가 개발 중에 있다. 항암제의 개발 목적은 보다 선택적이고 근원적으로 암을 정복하는 동
시에 독성으로 인한 부작용, 내성의 유발 및 재발을 극복하는 것이다. 특히, 기존의 치료방법에도 유방암 환자
의 사망률은 매우 높아 새로운 유방암치료제의 모색이 절실히 필요하다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 암을 치료하는데 유용한 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 <17>
이를 이용한 암 치료방법을 제공하는 데 있다.
발명의 구성 및 작용
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약<18>
학적으로 허용가능한 염, 이를 포함하는 암 치료용 조성물 및 이를 이용하는 암 치료방법을 제공한다.
화학식 1
<19>
상기 화학식 1에서, R1은 탄소수 1 내지 8의 직쇄상(linear) 또는 분지상(branched) 알킬이며, R2는 탄소수 1 <20>
내지 8의 직쇄상 또는 분지상 알킬, 알릴(allyl), 피리디닐메틸(pyridinylmethyl), 피리디닐에틸 및 피리디닐프
로필로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, R3는 치환되지 않은 벤조일(benzyol) 또는 탄소수 1 내지 3
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의 알킬로 치환된 벤조일이고, n은 1 내지 3의 정수이다.
바람직하게, 상기 화학식 1에서 R1은 부틸이며, R2는 알릴, 1-에틸프로필 및 피리디닐메틸로 이루어진 군으로부<21>
터 선택된 어느 하나이며, R3는 치환되지 않은 벤조일(benzyol)이고, n은 2이며, 더욱 바람직하게, 상기 화학식
1에서 R2는 알릴이다.
이하, 본 발명에 따른 새로운 암 치료제, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 암 치료방법에 대해 보다 상<22>
세히 설명한다.
본 발명은 트리아진 유도체 화합물 라이브러리(library) 중 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물<23>
들이 암, 특히 유방암을 치료하는데 탁월한 효과를 보인다는 점에 기초한다. 트리아진 유도체 화합물 라이브러
리는 본래 마이오서베린(myoseverin)-유사 항-튜불린 약물을 개발하고자 마이오서베린 유도체들로부터의 알려진
구조-활성 상관성(SAR) 데이터와 컴퓨터 이용 모델링(computer aided modeling)으로부터 고안되었으며(Moon,
H-S., et al., J Am Chem Soc., 124(39), 11608-11609 (2002) 참조). 이러한 트리아진 유도체 화합물 라이브러
리를 이용하여 배양된 유방암세포를 포함한 일련의 암세포를 이용하여 발굴된 항암 화합물의 효능을 검증하여
상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이 암, 특히 유방암에 탁
월한 효과를 보인다는 사실을 확인하였다.
또한 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물들 중에 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 Dan-<24>
BC1(C31H42N8O4, 분자량: 590.724), 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 Dan-BC2(C34H43N9O4, 분자량: 641.772) 및
하기 화학식 4로 표시되는 화합물 Dan-BC3(C33H48N8O4, 분자량: 620.793)가 종양 억제효율 등 여러 측면에서 암
치료에 더욱 효과적이다.
화학식 2
<25>
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화학식 3
<26>
화학식 4
<27>
발굴된 트리아진 유도체 화합물들을 이용하여 항암 효능을 파악하고자 유방암세포, 대장암세포, 신장암세포, 뇌<28>
암세포 등에서 화학적 유전적 스크리닝을 실시하고, 전술한 트리아진 유도체 화합물 라이브러리에서 상기 화학
식 1로 표시되는 화합물들, 보다 바람직하게는 상기 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 3가지 화합물들이
암세포 억제 활성에 있어 더욱 유용하다는 것을 밝혀내었다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 화합물들은 MCF-7 유방암 세포주(ATCC Number: HTB-22)에서 세포성장 억제효<29>
과가 가장 높았고, 다음은 MDA-MB-435(ATCC Number: HTB-129) 유방암 세포주, MDA-N 유방암 세포주(Wang,
J.J., et al., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004)) 순으로 세포성장 억제효과가 높았으며, HCT15(ATCC
Number: CCL-225) 대장암 세포주, NCI/ADR-RES 유방암 세포주(Ehrlichova, M., et al., Anticancer Res.,
25(6B), 4215-4224 (2005)), CAKI-1(ATCC Number: HTB-46) 신장암 세포주, ACHN (ATCC Number: CRL-1611) 신
장암 세포주, SF295 뇌암 세포주(Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet, 160(2), 126-133 (2005)) 및
UO-31 신장암 세포주 (Jansen, A.P., et al., Mol. Cancer Ther., 3(2), 103-110 (2004); Chen, Y-L., et
al., Eur J Med Chem., 40, 928-934 (2005))에서도 암세포 성장 억제효과를 나타내었다.
사용된 세포주 및 구체적 화합물의 종류에 따라 달라질 수는 있으나, 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물들<30>
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의 IC50 값은 약 10　uM 정도이고, 이들의 활성농도는 약 1　내지 10　uM이며, 세포독성(Cytotoxicity)은 약
100　uM까지 관찰되지 않았다.
본 발명의 "약학적으로 허용가능한 염"은 독성이 없거나 적은 산 또는 염기로 제조된 염들을 말한다. 본 발명의 <31>
화합물들이 상대적으로 산성일 경우 염기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기와 적당한 비활성(inert)
용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 나트륨,
칼륨, 칼슘, 암모늄, 마그네슘 또는 유기 아미노로 이루어진 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발
명의 화합물들이 상대적으로 염기성일 경우 산(acid) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 산과 적당한 비활성 용매
로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 프로피온산,
이소부틸산, 옥살산, 사과산, 말론산, 안식향산, 호박산, 수버릭(suberic), 푸마르산, 만데릭산, 프탈릭산, 벤
젠설폰산, p-토릴설폰산, 구연산, 주석산, 메탄설폰산, 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 일수소탄산
(monohydrogencarbonic), 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소, 아인산 등으로 형성
된 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 알지네이트(arginate) 같은 아미노산의 염 및 글루쿠로닉
(glucuronic) 또는 갈락투노릭(galactunoric) 산들과 같은 유기산의 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아
니다.
본 발명의 일부 화합물들은 수화물 형태를 포함하여 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated) 형태로 <32>
존재할 수도 있다. 본 발명의 일부 화합물들은 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리
적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다. 또한 본 발명의 일부 화합물들은 광학 중심인 비대칭 탄소원자들 또는
이중 결합들을 가질 수 있어 라세미체, 에난치오머, 디아스테레오머, 기하 이성질체 등이 존재할 수 있으며, 이
들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 약제학적으로 <33>
허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 트리아진 유도체 화합물 또는
이의 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있
고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있으며, 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등<34>
이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진
제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제,
현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨
가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, <35>
정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말
제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비
독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있
다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 매일 약 0.04 mg/kg 내지 약 20 <36>
mg/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.4 mg/kg 내지 약 2 mg/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량
은 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성, 사용된 화합물 등에 따라 다양할 수
있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 <37>
실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는
것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것
이다.
<실시예 1> 트리아진 유도체 화합물 라이브러리의 설계 및 합성<38>
트리아진 구조에 기초한 트리아진 유도체 화합물 라이브러리의 설계 및 합성은 Khersonsky, S.M. 등이 개시한 <39>
방법(J Am Chem Soc., 125, 11804-11805 (2003))에 기초하여 수행하였다. 간단하게, 트리아진 유도체 화합물
라이브러리를 제조하기 위하여 고체-상 방법(solid-phase method)이 사용되었으며, 세 가지 빌딩 블럭(building
block)들이 분리되어 제조되었고, 이들은 직교하여(orthogonally) 연결되어 1,536개의 순수한 트리아진 유도체
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등록특허 10-0761869
화합물들을 생성하였다.
보다 구체적으로, 하기 반응식 1에 나타나는 바와 같이, 세 가지 빌딩 블럭은 (Ⅰ) PAL-레진 결합 일차 아민, <40>
(Ⅱ) 2 위치에 아민, 알코올 또는 티올 부착된 4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진, 및 (Ⅲ) 일련의 일차 또는 이차
아민이다. 다양한 벤질아민을 포함하는 일차 아민이 환원 아미노화(reductive amination) 반응을 사용하여 PAL
알데히드 레진에 부착되어 빌딩 블럭 Ⅰ이 생성되었다. 또한 트리아진 트리클로라이드 상의 첫 번째 치환 반응
의 고 반응성을 이용하여 저 친핵성(low nucleophilic) 반응성을 가진 알킬/아릴 알코올, 벌키한(bulky) 아민
또는 아닐린이 도입되어 빌딩 블럭 Ⅱ가 제조되었다. 다양한 일차 및 이차 아민이 빌딩 블럭 Ⅲ으로 미리 준비
되었다.
미리 제조한 또는 상업적으로 이용가능한 상기 빌딩 블럭들을 이용한 이러한 간단한 합성 프로세스를 통하여, <41>
본원발명의 트리아진 유도체 화합물을 제조하였으며, 모든 제조된 화합물은 LC-MS로 확인되었고, 그 순도는 모
두 98% 이상이었다.
반응식 1
<42>
(a) R1NH2 (5 당량), 2% 아세트산의 THF, 실온, 1시간, 그 후, NaB(OAc)3H (7 당량), 실온, 12시간. <43>
(b) THF 내 R2R2'NH, R2OH 또는 R2SH (1 당량), 0℃, 1시간. <44>
(c) THF 내 빌딩 블럭 Ⅱ (4 당량), DIEA (4 당량), 60℃, 3시간.<45>
(c) NMP:n-BuOH의 1:1 혼합용매 내 R3R3'NH (4 당량), DIEA (4 당량), 120℃, 3시간.<46>
(e) DCM 내 5% TFA, 10분.<47>
<실시예 2> 세포 배양<48>
MCF-7 유방암 세포주(ATCC Number: HTB-22), MDA-MB-435(ATCC Number: HTB-129) 유방암 세포주, MDA-N 유방암 <49>
세포주(Wang, J.J., et al., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004), HCT15(ATCC Number: CCL-225) 대장암
세포주, NCI/ADR-RES 유방암 세포주(Ehrlichova, M., et al., Anticancer Res., 25(6B), 4215-4224 (2005),
CAKI-1(ATCC Number: HTB-46) 신장암 세포주, ACHN(ATCC Number: CRL-1611) 신장암 세포주, SF295 뇌암 세포주
(Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet, 160(2), 126-133 (2005)) 및 UO-31 신장암 세포주(Jansen,
A.P., et al., Mol. Cancer Ther., 3(2), 103-110 (2004); Chen, Y-L., et al., Eur J Med Chem., 40, 928-
934 (2005))의 암세포들은 37℃, 5% CO2가 포함된 세포 배양기에서 배양시켰다. 배양 및 계대 시에는 10% 우태
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아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 성장시켰다.
<실시예 3-1> 암 세포를 이용한 트리아진 유도체 화합물들의 스크리닝<50>
동결건조된 라이브러리 화합물들을 디메틸셀폭사이드(DMSO)에 재현탁하여 최종 농도를 10　mM가 되게 하였다. <51>
라이브러리 화합물을 첨가하기 하루 전에 암 세포들을 24-웰 플레이트에 1 ml의 배양 매질로 웰 당 5×10
4
　세
포가 되게 위치시켰다. 모든 화합물들을 표시된 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 모든 실험에 있어, DMSO를 음
성 대조군으로 사용하였다. 세포들은 다른 표시가 없는 한 72시간 동안 배양되었고, 세포 생존률은 CellTiter
96 수성 비-방사활성 세포 증식 분석(aqueous non-radioactive cell proliferation assay)(Promega, Madison,
WI, USA)를 이용하여 측정되었다..
CellTiter 96™ AQueous 비-방사활성 세포 증식 분석은 세포증식, 세포독성 또는 화학민감(chemosensitivity) <52>
분석에 있어 생존 세포의 수를 측정하기 위한 균일하고, 비색계적(colorimetric) 방법이다. CellTiter 96
AQueous 분석은 새로운 테트라졸리움
화합물(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움, 내부 염(inner
salt), MTS)과 전자 커플링 시약(phenazine methosulfate, PMS)로 이루어져 있다. MTS는 조직 배양 매질 내로
용해되는 포르마잔(formazan) 프로덕트로 세포에 의해 생환원(bio-reduce)된다. 이 포르마잔 프로덕트의 490 nm
흡광도가 96-웰 분석 플레이트로부터 추가적인 처리 없이 직접 측정될 수 있다. MTS의 수용성 포르마잔 프로덕
트로의 전환은 대사적으로 활성인 세포에서 발견되는 디하이드로게나제 효소에 의해 수행된다. 490 nm 흡광도의
양으로 측정되는 포르마잔 프로덕트의 양은 배양액 중 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다.
<실시예 3-2> 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 또는 Dan-BC3가 유방암 세포주 생존도(viability)에 미치는 영향평가<53>
MCF-7 유방암 세포주에 각각의 화합물을 농도별로 투여 후 유방암세포의 활성을 관찰하였다. MCF-7 세포 2×10
5
<54>
개를 6웰 플레이트에 각각 분주하여 성장시켰다. 그 후 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3를 약제투여 농도인
10, 50 및 100 uM이 되도록 희석하여 암세포에 농도별로 2일간 처리한 후 세포 생존도를 약제를 처치하지 않은
군과 비교 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 상기 3 가지 화합물들이 MCF-7 유방암세포의 성장을 억제하는 것을 보여주는 사진(200배 확대)을 나타내<55>
었다. 도 1에 나타나는 바와 같이, Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 모두에서 10 uM 농도에서는 세포성장 억제효과
가 미약했으며 50 uM 농도에서도 아주 뚜렷한 세포성장억제효과를 볼 수 없었으나, 100 uM 농도에서는 세포 사
멸효과를 육안으로 쉽게 확인할 수 있었다. 따라서 각 트리아진 유도체 화합물의 투여농도를 100 uM로 정하여
후속 실험을 진행하였다.
도 2에 MCF-7 유방암세포를 상기 세 가지 화합물 100 uM로 처리한 후 성장 억제 정도를 나타내었다. 유방암세포<56>
에 대한 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 성장억제효과를 보면 Dan-BC3는 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은
유방암세포주에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 60%가 생존하였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암
세포주에 비하여 약 37%만이 생존하였고 36시간째에는 약 7% 및 48시간째에는 모든 세포가 사멸에 이르렀다.
Dan-BC1은 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 68%가 생존하
였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 약 37%만이 생존하였고 36시간째에는 약 27%
및 48시간째에는 모든 세포가 사멸에 이르렀다. Dan-BC2는 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은 유방암세포주
에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 75%가 생존하였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비
하여 약 49%만이 생존하였고 36시간째에는 약 33% 및 48시간째에는 20%만이 생존하였다.
<실시예 4-1> 누드마우스에 유방암 종괴의 형성 및 시험 화합물의 평가<57>
누드마우스에서 MCF-7 종양세포의 종양형성 능력을 측정하기 위하여 생후 4-5주된 암컷 누드마우스(BALB/c계 <58>
athymic nu/nu)를 대상으로 트립판(trypan) 블루 염료 배제(dye exclusion) 검사상 생존도가 95% 이상인 5×10
6
개의 MCF-7 종양세포를 200 ㎕의 PBS에 섞어 30 마리에게 피하부위에 접종하였고 이후 2주에서 2개월까지 성장
시킨 후 형성된 종양의 직경이 10-25mm 이상이 되는 경우 시험 화합물의 투여를 시작하였다. 시험 화합물은 종
양크기 측정 2일 후 투여하기 시작하였으며 일주일 간격으로 투여하였고 최초 투여 농도는 각각 500 uM로 하였
다. 시험 화합물이 투여되지 않은 종양이 형성된 누드마우스의 사진을 도 3에 나타내었으며, 종양의 크기는 장
경 25 mm, 단경 20 mm, 높이 15 mm, 체중 27 g이었다.
<실시예 4-2> 각 화합물들의 생체 내 유방암 억제효과 평가<59>
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등록특허 10-0761869
실시예 4-1과 같이 누드마우스에 유방암을 형성시킨 후 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물인 Dan-BC1, <60>
Dan-BC2 및 Dan-BC3를 투여하여 종괴크기의 변화를 관찰하였다. 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3를 500 uM
씩 2회 투여 후 동일한 시간이 지난 상기 실시예 4-1의 음성 대조군의 유방암 종괴 크기(장경 25 mm, 단경 20
mm, 높이 15 mm)와 비교한 결과, 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 투여 후 종괴크기는 크기가 각각 하기
표 1, 2 및 3에 기재한 정도로 감소하여 누드마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 본 발명의 트리아진 유
도체 화합물의 강력한 항암효과를 확인할 수 있었다. 각각의 사진을 도 4, 5 및 6에 나타내었다.
【표 1】
화합물 Dan-BC1<61> 약물농도(uM) 장경(mm) 단경(mm) 높이(mm) 체중(g)
최초투여 1일 전 - 4 2 2 18.5
최초투여 당일 500 12 10 5 21.2
최초투여 1주일 후 500 10 8 2 19.5
【표 2】
화합물 Dan-BC2<62> 약물농도(uM) 장경(mm) 단경(mm) 높이(mm) 체중(g)
최초투여 1일 전 - 4 2 2 19.5
최초투여 당일 500 12 10 5 21.2
최초투여 1주일 후 500 15 10 3 20.5
【표 3】
화합물 Dan-BC3<63> 약물농도(uM) 장경(mm) 단경(mm) 높이(mm) 체중(g)
최초투여 1일 전 - 4 2 2 19.5
최초투여 당일 500 12 7 5 21.2
최초투여 1주일 후 500 15 10 2 20.5
상기 표 1, 2 및 3의 결과를 종합하여 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타나는 바와 같이 누드마우스에서 각 화합<64>
물들의 유방암세포 사멸효과는 화합물 Dan-BC1이 가장 높았고, 다음은 화합물 Dan-BC3, 그리고 화합물 Dan-
BC2의 순서로 항암효과가 나타났다.
<실시예 5-1> 암형성 형질전환 동물모델을 이용한 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 항암효과 평가<65>
포유동물에서 과발현되어 암을 유발하는 인간 원암유전자로 형질전환된 마우스를 이용하여 본 발명에 따른 화합<66>
물인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 항암효과를 평가하였다.
마우스를 형질전환시키기 위해 사용된 세포주는 종양형성능을 가지고 있어, 포유동물에 이식될 경우 촉지성 종<67>
양(palpable tumor)과 같은 암종을 형성한다. 본 실험에 사용된 세포주는 인간 원암유전자(이하, HCCR-1)을 과
발현하여 다량의 HCCR-1 단백질을 생성하며, 이 단백질이 암과 관련된 것으로 보고된 바 있는 D52 단백질
(GenBank 등록번호 NM003288)(Byrne, J.A. et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); 및 Bryne, J.A. et
al., Oncogene, 16, 873-881 (1998) 참조)과 상호작용하고, 단백질 키네이즈C 및 텔로머레이즈를 활성화시키며,
세포주기 체크포이트(Checkpoint) 조절 기능을 상실하게 하고, egr-1 유전자의 발현을 하향 조절하는 과정을 거
쳐 악성 종양으로 전환한다. 특히 이 과정에서 세포주기 조절에 관련된 종양억제 유전자 p53의 발현이 증가되지
만 생성된 p53 단백질의 대부분이 불활성화됨으로써 종양 억제 기능을 다하지 못해 악성 종양으로 전환되는 것
으로 보인다. 즉, HCCR-1은 상위 단계(upstream level)에서 종양 억제 유전자 p53의 기능을 불활성화시키는 것
으로 보인다(대한민국특허 등록번호 제426452호 "인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를 이용
한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트"; 및 대한민국특허 등록번호 제367978호 "인간 자궁경부암 1
원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질" 참조).
따라서, 이러한 형질전환 포유동물은 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하여 암을 형성하므로 항암성 물질의 탐<68>
색 등에 유용하게 사용될 수 있고, 특히 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암에 효과적인 약물의 스크리닝에 유용
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하다.
암형성 형질전환 마우스 암컷에서 자연히 형성된 유방암들에 본 발명에 따른 화합물들인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 <69>
Dan-BC3을 각각 100 uM씩 일주일 간격으로 투여한 후 종양억제효과를 관찰하였으며, 각각의 결과를 도 8, 9 및
10에 나타내었고, 각각의 결과를 종합하여 도 11에 그래프로 나타내었다.
도 8에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC1를 100 uM씩 2회 투여하였<70>
다. 화합물 Dan-BC1의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으며, 따라서 화합물 Dan-BC1은 유방암
형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 강력한 항암효과를 나타내었다.
도 9에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC2 100 uM을 1회 투여 후 유<71>
방암이 소실되었다. Dan-BC2의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으나 이차주사시에는 다시 종양
의 형성이 유도되었다. 화합물 Dan-BC2은 유방암 형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 항암효과를 나
타내었다.
도 10에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC3 100 uM을 1회 투여 후 유<72>
방암이 소실되었다. Dan-BC3의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으나 이차주사시에는 다시 종양
의 형성이 유도되었다. 화합물 Dan-BC3은 유방암 형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 항암효과
를 나타내었다.
이상의 결과를 종합하여 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타나는 바와 같이, 암발생 형질전환 동물모델에서 본 <73>
발명에 따른 트리아진 유도체 화합물인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 중 Dan-BC1의 효과가 가장 탁월하였으며,
다음은 Dan-BC3 그리고 Dan-BC2의 순서로 효과에 차이가 있었다.
발명의 효과
본 발명은 암을 치료하는데 유용한 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허<74>
용가능한 염, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 치료방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물들이 MCF-7 유방암세포의 성장을 억제하는 것을 보여주는 200배 확대 <1>
사진이다.
도 2는 MCF-7 유방암세포를 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 100 uM로 처리한 후 성장 억제 정도를 나타낸 <2>
그래프이다.
도 3은 음성 대조군의 실험결과로 누드마우스에 MCF-7 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴를 보여주는 <3>
사진이다.
도 4는 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-<4>
BC1 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
도 5는 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-<5>
BC2 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
도 6은 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-<6>
BC3 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
도 7은 유방암이 유도된 누드마우스에서 본 발명의 일 실시예인 트리아진 유도체 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 <7>
Dan-BC3의 종양억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 8은 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-BC1 <8>
투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
도 9는 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-BC2 <9>
투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
도 10은 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-<10>
BC3 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.
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도 11은 암형성 형질전환 동물 모델에서 본 발명의 일 실시예인 트리아진 유도체 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 <11>
Dan-BC3의 종양억제 효과를 비교한 그래프이다.
도면
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