(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(45) 공고일자 2011년10월10일
(11) 등록번호 10-1071430
(24) 등록일자 2011년09월30일
(51) Int. Cl.

G01N 33/543 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01)
G01N 33/533 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2005-7002300
(22) 출원일자(국제출원일자) 2003년07월10일
심사청구일자 2008년05월08일
(85) 번역문제출일자 2005년02월07일
(65) 공개번호 10-2005-0062531
(43) 공개일자 2005년06월23일
(86) 국제출원번호 PCT/US2003/021520
(87) 국제공개번호 WO 2004/021004
국제공개일자 2004년03월11일
(30) 우선권주장
10/228,836 2002년08월27일 미국(US)
10/286,342 2002년11월01일 미국(US)
(56) 선행기술조사문헌
WO2002033408 A1*
*는 심사관에 의하여 인용된 문헌
(73) 특허권자
킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
미국 위스콘신주 (우편번호: 54957-0349) 니나 노
쓰 레이크 스트리트 401
(72) 발명자
송, 쉐동
미국 30076 조지아주 로즈웰 크랩애플 레이크 서
클 1135
케일러, 로잔
미국 30041 조지아주 커밍 윌리암스버그 드라이브
7480
(뒷면에 계속)
(74) 대리인
장수길, 위혜숙
전체 청구항 수 : 총 20 항 심사관 : 이현지
(54) 시분해 형광을 이용한 막 기반 분석법
(57) 요 약
본 발명은 시험 샘플 내의 잔류 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 막-기반 분석 장치에 관한 것이다. 이
장치는 여기된 발광 표지에 의해 발생하는 신호를 검출하기 위해 시분해 형광을 이용한다. 상기 표지들이 비교
적 긴 방출 수명을 가질 수 있으므로, 지연된 형광 검출을 통해 짧은 수명의 배경 방해가 사실상 제거될 수
있다. 또한, 그 결과 형광 판독기는 간단하고 비싸지 않은 디자인을 지닐 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에
서, 판독기는 표지를 정확하게 여기하기 위해 실리콘 광다이오드 및 펄스 발광 다이오드 (LED)를 이용할 수
있고, 모노크로매터 또는 좁은 방출 띠폭 광학 필터와 같은 고가의 부품을 사용하지 않고도 막-기반 분석 장치상
의 형광을 검출할 수 있다.
대 표 도 - 도1
등록특허 10-1071430
- 1 -
(72) 발명자
크놋츠, 마이클
미국 30075 조지아주 로즈웰 스프링 힐 테라스 210
웨이, 닝
미국 30075 조지아주 로즈웰 섬머힐 드라이브 530
등록특허 10-1071430
- 2 -
특허청구의 범위
청구항 1
i) 컨쥬게이트 패드에 유체가 통과할 수 있는 다공성 막을 포함하며, 컨쥬게이트 패드는 분석물과 결합하도록
구성된 특이적 결합 부재로 변형된 입자 및 약 1 마이크로초를 초과하는 형광 방출 수명을 갖는 형광 표지를 함
유하는 접합 프로브들을 포함하고, 다공성 막은 프로브 접합체/분석물 복합체에 대하여 결합 자리를 제공하거나
프로브와 화학적 또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 포획제가 그 안에 고정된 검출 구역 및 검출 구역으로부터
하류에 위치하고 분석물에 결합하지 않고 검출 구역을 통해 이동된 나머지 비포획 프로브에 결합할 수 있는 포
획제가 그 안에 고정된 교정 구역을 형성하는 것인 유통 분석 장치를 제공하는 단계,
ii) 시험 샘플과 접합 프로브의 혼합물을 형성하기 위해 상기 컨쥬게이트 패드를 시험 샘플과 접촉시키는 단계,
iii) 상기 혼합물을 상기 검출 구역 및 상기 교정 구역으로 유동하게 하는 단계,
iv) 펄스 여기원 및 시간 게이트 검출기를 포함하는 시분해 형광 판독기를 상기 검출 구역 및 상기 교정 구역에
인접하여 위치시키는 단계,
v) 상기 형광 표지를 상기 검출 구역 및 상기 교정 구역에서 상기 펄스 여기원으로 여기시켜, 상기 형광 표지가
상기 검출 구역에서의 검출 신호 및 상기 교정 구역에서의 교정 신호를 방출하게 하는 단계,
vi) 상기 시간 게이트 검출기로 상기 검출 신호 및 상기 교정 신호의 강도를 측정하는 단계, 및
vii) 상기 교정 신호와 상기 검출 신호의 강도를 비교하는 단계 (이때 시험 샘플 내의 분석물의 양이 교정 신호
의 강도에 의해 교정된 검출 신호의 강도에 비례함)
를 포함하는, 시험 샘플 내 잔류 분석물의 존재 또는 양의 검출 방법.
청구항 2
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 약 10 마이크로초를 초과하는 방출 수명을 갖는 방법.
청구항 3
삭제
청구항 4
삭제
청구항 5
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 약 100 나노미터를 초과하는 스토크스 이동을 갖는 방법.
청구항 6
삭제
청구항 7
삭제
청구항 8
삭제
청구항 9
삭제
청구항 10
삭제
등록특허 10-1071430
- 3 -
청구항 11
삭제
청구항 12
삭제
청구항 13
삭제
청구항 14
삭제
청구항 15
삭제
청구항 16
삭제
청구항 17
삭제
청구항 18
삭제
청구항 19
삭제
청구항 20
삭제
청구항 21
삭제
청구항 22
제1항에 있어서, 광학 필터를 상기 펄스 여기원, 상기 시간 게이트 검출기 또는 이들의 조합에 근접하여 배치하
는 방법.
청구항 23
삭제
청구항 24
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 약 100 내지 약 1000 마이크로초의 방출 수명을 갖는 방법.
청구항 25
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 약 50 나노미터를 초과하는 스토크스 이동을 갖는 방법.
청구항 26
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 약 250 내지 약 350 나노미터의 스토크스 이동을 갖는 방법.
등록특허 10-1071430
- 4 -
청구항 27
제1항에 있어서, 상기 형광 표지가 사마륨, 디스프로슘, 유러퓸, 테르븀, 또는 이들의 조합의 란탄족 킬레이트
를 포함하는 방법.
청구항 28
제27항에 있어서, 상기 형광 표지가 유러퓸 킬레이트인 방법.
청구항 29
제1항에 있어서, 상기 검출 구역의 상기 형광 표지를 상기 교정 구역의 상기 형광 표지와 동시에 여기하는
방법.
청구항 30
제1항에 있어서, 상기 검출 신호 및 상기 교정 신호를 동시에 측정하는 방법.
청구항 31
제1항에 있어서, 상기 펄스 여기원이 펄스 발광 다이오드인 방법.
청구항 32
제1항에 있어서, 상기 시간 게이트 검출기가 실리콘 광다이오드인 방법.
청구항 33
제1항에 있어서, 상기 형광 판독기가 상기 펄스 여기원 및 상기 시간 게이트 검출기와 연결된 시한 회로를 함유
하고, 상기 시한 회로가 펄스 여기 및 검출을 제어하는 방법.
청구항 34
제1항에 있어서, 검출 구역 내의 포획제가 항원 또는 항체인 방법.
청구항 35
제1항에 있어서, 교정 구역 내의 포획제가 고분자전해질인 방법.
청구항 36
제1항에 있어서, 검출 신호의 강도가 형광 표지 여기 후 특정 시간에 측정되는 방법.
청구항 37
제36항에 있어서, 검출 신호의 강도가 약 100 내지 약 200 마이크로초 후 측정되는 방법.
청구항 38
제1항에 있어서, 교정 신호의 강도가 형광 표지 여기 후 특정 시간에 측정되는 방법.
청구항 39
제1항에 있어서, 프로브의 양이 검출 구역에서 이용가능한 결합 자리의 양을 초과하는 것인 방법.
청구항 40
삭제
청구항 41
삭제
등록특허 10-1071430
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청구항 42
삭제
명 세 서
<관련 출원>[0001]
본 출원은 2002년 8월 27일에 제출된 미국 출원 제 10/228,836호의 일부 계속 출원이다.[0002]
배 경 기 술
분석물의 검출을 용이하게 하는 형광 표지를 도입하는 분석법이 개발되어 왔다. 형광은 일반적으로 3 단계 과[0003]
정의 결과이다. 제1 단계로, 에너지가 외부원, 가령 백열등 또는 레이져에 의해 공급되고 형광 화합물에 의해
흡수되어 여기된 단일항의 전자 상태를 발생시킨다. 제2 단계로, 여기된 상태는 형광 화합물이 형태 변화하는
한정된 시간 동안 존재하고, 또한 그의 분자 환경과 다수의 가능한 상호작용을 한다. 이 시간 동안 여기 상태
의 에너지가 부분적으로 소산되어, 형광 방출이 발생하는 완화 상태를 가져온다. 제3 단계는 에너지가 방출되
어 형광 화합물이 그의 바닥 상태로 되돌아가는 형광 방출 단계이다. 방출된 에너지는 그 여기 에너지 (빛 또
는 레이져)보다 낮으므로 더 긴 파장을 갖는다. 이러한 에너지 또는 파장에서의 이동 또는 차이는 방출 에너지
가 여기 에너지로부터 검출되고 분리될 수 있게 한다.
통상적인 형광 검출은 여기 광자로부터 방출 광자를 분리하기 위해 일반적으로 파장 필터링을 이용하고, 방출[0004]
광자를 기록하고 보통 전기 신호 또는 사진상으로 기록가능한 결과를 나타내는 검출기를 이용한다. 그러나, 통
상적인 형광 검출 기법에는 몇 가지 문제가 있다. 예를 들어, 대부분의 생물학적 유체는 검출 정확도를 감소시
킬 수 있는 자체형광 (autofluorescence)을 포함한다. 분석 장치 역시 자체형광을 가질 수 있다. 이런 방해는
예컨대 20 내지 50 나노미터인 많은 통상적인 형광 표지의 작은 스토크스 (Stokes) 이동에 의해 증강될 수
있다.
통상적인 형광 검출 기법이 갖는 일부 문제점들에 대응하여 "시분해" 형광으로 알려진 기법이 개발되었다. 시[0005]
분해 형광은 형광 표지를 짧은 펄스의 빛으로 여기시키고, 긴 수명의 나머지 형광 신호를 측정하기 전에 여기
후 일정 시간 (예컨대, 약 100 내지 200 마이크로초) 기다리는 것을 포함한다. 이러한 방식으로, 짧은 수명의
임의의 형광 배경 신호 및 산란된 여기 방사선이 제거된다. "시분해" 기법이 큐벳 기반 기기와 같은 일부 유형
의 분석 장치에 성공적으로 도입되기는 하였으나, 그럼에도 막 기반 장치와 같은 다른 유형의 분석 장치에서는
시분해 기법을 결합하는 데 문제가 있었다.
특히, 통상적인 시분해 시스템, 예컨대 모노크로매터에 기반한 것들은 매우 복잡하고 값비싼 기기들을[0006]
포함한다. 예를 들어, 일반적인 연구 등급의 실험용 형광계는 여기 파장을 선별하는데 이용되는 하나의 모노크
로매터와 검출 파장을 선별하는데 이용되는 또 다른 모노크로매터를 갖는 이중 모노크로매터 시스템이다. 이
수준의 복잡성은 시스템의 가격을 크게 증가시키고, 또한 부피가 크고 휴대할 수 없으며 무거운 기기를 요구한
다. 게다가, 통상적인 시분해 시스템은 막 기반 분석 장치와 함께 이용되는 경우에도 문제가 있다. 전형적으
로, 막 기반 장치에서 분석물의 농도는 다공성 막을 유통할 수 있는 액체에 의해 희석되므로 감소된다. 불행히
도, 검출되는 형광 강도가 비교적 낮기 때문에 배경 방해는 그러한 낮은 분석물 농도에서는 점점 문제가 된다.
막의 구조 또한 방출된 빛을 반사하는 경향이 있으므로, 검출기가 표지된 분석물의 형광 강도를 정확하게 측정
하는 능력은 실질적으로 감소된다. 사실상, 방출된 형광 신호의 강도는 일반적으로 다공성 막에 의해 반사된
여기광보다 3 내지 4 차수의 크기로 작다.
그러므로, 막 기반 분석 장치에서 형광을 측정하기 위한 단순하고 비싸지 않으며 효과적인 시스템이 현재 필요[0007]
하다.
발명의 상세한 설명
<발명의 요약>[0008]
등록특허 10-1071430
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본 발명의 일 실시태양에 따르면, 시험 샘플에 존재하는 분석물의 유무 또는 양을 검출하는 방법은 [0009]
i) 약 1 마이크로초를 초과하는 형광 방출 수명을 갖는 형광 표지에 유체가 통과할 수 있는, 검출 구역을 이루[0010]
는 다공성 막을 포함하는 유통 분석 장치를 제공하는 것,
ii) 혼합물 (예컨대 용액, 현탁액 등)을 형성하기 위해 시험 샘플을 형광 표지와 접촉시키는 것,[0011]
iii) 혼합물을 검출 구역으로 유동하게 하는 것,[0012]
iv) 펄스 여기원 (pulsed excitation source) 및 시간 게이트 검출기 (time gated detector)를 포함하는 시분[0013]
해 형광 판독기를 검출 구역에 인접하게 위치시키는 것,
v) 형광 표지를 펄스화 여기원으로 검출 구역에서 여기시키고, 이때 여기에 의해 형광 표지가 검출 신호를 방출[0014]
하는 것;
vi) 시간 게이트 검출기로 검출 신호의 강도를 측정하는 것[0015]
을 포함하는 것으로 개시되어 있다.[0016]
형광 표지는 사마륨, 디스프로슘, 유러퓸, 테르븀 또는 이들의 조합의 란탄족 킬레이트를 포함할 수 있다. 더[0017]
욱이, 몇몇 실시태양에서 형광 표지는 약 10 마이크로초를 초과하고, 어떤 실시태양에서는 약 50 마이크로초를
초과하며, 어떤 실시태양에서는 약 100 내지 약 1000 마이크로초의 방출 수명을 가질 수 있다. 마찬가지로, 형
광 표지는 약 50 나노미터를 초과하고, 몇몇 실시태양에서는 약 100 나노미터를 초과하며, 어떤 실시태양에서는
약 250 내지 약 350 나노미터인 스토크 이동을 가질 수 있다. 필요한 경우, 표지는 분석물에 대한 특이적 결합
원으로 변형된 마이크로입자와 연결하여 이용할 수 있다.
형광 판독기는 표지를 정확하게 여기시키고, 모노크로매터 또는 좁은 방출 띠폭 광학 필터와 같은 고가의 부품[0018]
을 사용할 필요 없이 막 기반 분석 장치상에서 형광을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시태양에서 예를
들어 펄스 여기원은 실리콘 광다이오드이다. 형광 판독기는 신호 펄스화 및 검출을 제어하기 위해 펄스 여기원
및 시간 게이트 검출기와 연결된 시한 회로 (예를 들어, A/D 변환기, 마이크로프로세서, 증폭기, 분배기, 결정
발진기, 트랜지스터, 플립-플롭 회로 등)를 함유할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, 시험 샘플 내 잔류 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 방법은 [0019]
i) 약 50 마이크로초를 초과하는 형광 방출 수명 및 약 100 나노미터를 초과하는 스토크스 이동을 갖는 란탄족[0020]
킬레이트를 함유하는 접합 프로브에 유체가 통과할 수 있는, 검출 구역 및 교정 구역을 이루는 다공성 막을 포
함하는 유통 분석 장치를 제공하는 것,
ii) 혼합물을 형성하기 위해 접합 프로브와 시험 샘플을 접촉시키는 것,[0021]
iii) 혼합물이 검출 구역 및 교정 구역으로 유동하게 하는 것,[0022]
iv) 펄스 발광 다이오드 및 실리콘 광다이오드를 포함하는 시간 게이트 검출기, 및 이들의 조합을 포함하는 시[0023]
분해 형광 판독기를 검출 구역 및 교정 구역에 인접하여 위치시키는 것,
v) 펄스 발광 다이오드로 검출 구역 및 교정 구역에서 란탄족 킬레이트를 여기시키고, 이때 여기에 의해 검출구[0024]
역에서의 란탄족 킬레이트가 검출 신호를 방출하고 교정 구역에서의 란탄족 킬레이트가 교정 신호를 방출하는
것,
vi) 시간 게이트 검출기로 검출 신호 및 교정 신호의 강도를 측정하는 것,[0025]
vii) 교정 신호에 대한 검출 신호의 강도를 비교하고, 이때 시험 샘플 내의 분석물의 양이 교정 신호의 강도에[0026]
의해 교정된 검출 신호의 강도에 비례하는 것
을 포함하는 것으로 개시되어 있다.[0027]
검출 구역의 형광 표지는 교정 구역의 형광 표지와 동시에 또는 별도로 여기될 수 있다. 마찬가지로, 검출 신[0028]
호 및 교정 신호 또한 동시에 또는 별도로 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 특징들을 아래에서 훨씬 자세히 논의한다.[0029]
등록특허 10-1071430
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<도면의 간단한 설명>[0030]
본 발명의 최적의 방식을 비롯하여 당 기술분야의 통상의 기술을 가진자를 위한 본 발명의 완전하고도 실시가능[0031]
한 개시가 본 명세서의 나머지 부분에 더 상세히 제시되어 있고, 이는 첨부된 하기의 도면을 참조로 한다.
도 1은 본 발명의 막 기반 장치의 일 실시태양의 사시도이다.[0032]
도 2는 대표적인 전자 부품을 포함한, 본 발명에서 사용될 수 있는 시분해 형광 판독기의 일 실시태양의 개략도[0033]
이다.
도 3은 대표적인 전자 부품을 포함한, 본 발명에서 사용될 수 있는 시분해 형광 판독기의 또 다른 실시태양의[0034]
개략도이다.
도 4는 대표적인 전자 부품을 포함한, 본 발명에서 사용될 수 있는 시분해 형광 판독기의 또 다른 실시태양의[0035]
개략도이다.
도 5는 실시예 2에서 얻어진 결과에 대한 정규화된 여기 및 방출 스펙트럼의 그래프이다.[0036]
도 6은 실시예 4에서 얻어진 결과에 대한 정규화된 형광 강도 대 분석물 농도 (밀리리터 당 나노그램)의 그래프[0037]
이다.
본 명세서 및 도면에 있어서의 반복적인 참조 부호의 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 구성요소[0038]
를 나타내려는 것이다.
<정의>[0039]
본원에서 사용되는 용어 "분석물"은 일반적으로 검출되는 물질을 의미한다. 예를 들어, 분석물은 항원성 물질,[0040]
합텐, 항체 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 분석물은 톡신, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미세유기체,
아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물 (치료 목적으로 투여되는 약물 및 금지된 목적으로 투여되
는 약물을 포함), 약물 중간체 또는 부산물, 세균, 바이러스 입자 및 상기 임의의 물질의 대사산물 또는 상기
물질에 대한 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 몇몇 분석물의 구체적인 예는 페리틴, 크레아티닌 키나
제 MIB (CK-MB), 디곡신, 페니토인, 페노바르비톨, 카르바마제핀, 반코마이신, 겐타마이신, 테오필린,
발프로산, 퀴니딘, 혈청황색소화 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 에스트라디올, 프로게스테론, C-반응성
단백질, IgE 항체, 비타민 B2 마이크로글로불린, 당화 헤모글로빈 (Gly. Hb), 코르티졸, 디기톡신, N-아세틸프
로카인아미드 (NAPA), 프로카인아미드, 풍진에 대한 항체, 예를 들어 풍진-IgG 및 풍진 IgM, 주혈원충증에 대한
항체, 예를 들어 주혈원충증 IgG (Toxo-IgG) 및 주혈원충증 IgM (Toxo-IgM), 테스토스테론, 살리실레이트, 아세
트아미노펜, B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 코어 항원에 대한 항체, 예를 들어 B형 간염 코어
항원 IgG 및 IgM (항-HBC), 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2 (HIV 1 및 2), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 및
2 (HTLV), Be형 간염 항원 (HBeAg), Be형 간염 항원에 대한 항체 (항-HBe), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 티록신
(T4), 총 트리요오도티로닌 (총 T3), 유리 트리요오도티로닌 (유리 T3), 태아성암 항원 (CEA) 및 알파 태아 단
백질 (AFP)을 포함한다. 남용 약물 및 통제 물질은 암페타민, 메탐페타민, 바르비투레이트, 예를 들어 아모바
르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈 및 바르비탈, 벤조디아제핀, 예를 들어 리브륨 및 발륨, 칸
나비노이드, 예를 들어 해시시 및 마리화나, 코카인, 펜타닐, LSD, 메타쿠알론, 진정제, 예를 들어 헤로인, 몰
핀, 코데인, 히드로모르폰, 히드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 아편, 펜시클리딘 및 프로폭시헨을
포함하고, 이로 제한되지 않는다. 다른 잠재적인 분석물은 미국 특허 제6,436,651호 (에버하르트 등), 제
4,366,241호 (톰 등)에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "시험 샘플"은 일반적으로 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 물질을 의미한다. 시험[0041]
샘플은 공급원으로부터 입수한 상태로 직접 사용하거나 샘플의 특성을 변경시키기 위해 전처리한 후에 사용할
수 있다. 시험 샘플은 임의의 생물학적 공급원, 예를 들어 혈액, 간질액, 타액, 안 렌즈액, 뇌척수액, 땀, 뇨,
유즙, 복수 유체, 점액, 활액, 복막액, 질액, 양막액 등을 포함하는 생리학적 유체로부터 유래할 수 있다. 시
험 샘플은 사용 전에 예를 들어 혈액으로부터 혈장의 제조, 점액의 희석 등과 같이 전처리될 수 있다. 처리 방
법은 저해 성분의 여과, 침전, 희석, 증류, 농축, 불활성화 및 시약의 첨가를 수반할 수 있다. 생리학적 유체
이외에, 다른 액체 샘플, 예를 들어 환경 또는 식품 제조 분석을 수행하기 위한 물, 식품 등을 사용할 수 있다.
또한, 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 고체 물질을 시험 샘플로서 사용할 수 있다. 일부 경우에, 액체 매
등록특허 10-1071430
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질을 형성하거나 분석물을 방출시키기 위해서 고체 시험 샘플을 변형시키는 것이 유리할 수 있다.
<상세한 설명>[0042]
그의 하나 이상의 예가 아래에 제시되는 본 발명의 상이한 실시태양을 참고로 하여 보다 상세하게 설명한다.[0043]
각각의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제시된 것으로서 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 실제로, 당업계
의 숙련인은 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않는 상이한 변형 및 변경을 가할 수 있음을 알 것이다. 예를
들어, 한 실시태양의 일부로서 예시되거나 설명된 특징은 다른 실시태양을 설명하기 위해서 다른 실시태양에 사
용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구 범위 및 그의 균등물에 포함되는 상기 변형 및 변경을 포함
하는 것으로 의도된다.
일반적으로, 본 발명은 샘플 내의 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 막 기반 분석 장치에 관한 것이다.[0044]
이 장치는 여기된 형광 표지에 의해 발생되는 신호를 검출하기 위해 시분해 형광을 이용한다. 표지는 긴 방출
수명을 지닐 수 있으므로, 산란광 및 자체형광과 같은 많은 원인으로부터의 배경 방해가 검출 동안 실질적으로
제거될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 형광 판독기는 간단하고 비싸지 않은 디자인을 지닐 수 있다.
예를 들어, 일 실시태양에서 판독기는 펄스 발광 다이오드 (LED) 및 실리콘 광다이오드를 이용하여 표지를 정확
하게 여기시키고 모노크로매터 또는 좁은 방출띠폭 광학 필터와 같은 고가의 부품을 사용하지 않고도 막 기반
분석 장치 상의 형광을 검출할 수 있다.
도 1을 참고로 하여, 예를 들어 본 발명에 따라 형성될 수 있는 유통 분석 장치 (20)의 일 실시태양을 아래에서[0045]
보다 상세하게 설명한다. 도시된 바와 같이, 장치 (20)은 경질 물질 (21)에 의해 임의로 지지된 다공성 막
(23)을 포함한다. 일반적으로, 다공성 막 (23)은 시험 샘플이 그를 통과할 수 있는 다양한 물질로 형성될 수
있다. 예를 들어, 다공성 막 (23)을 형성하기 위해 사용되는 물질은 천연, 합성 또는 합성에 의해 개질된 천연
물질, 예를 들어 폴리사카라이드 (예를 들어 셀룰로스 물질, 예를 들어 종이 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어 셀
룰로스 아세테이트 및 니트로셀룰로스), 폴리에테르 술폰, 나일론 막, 실리카, 중합체, 예를 들어 비닐 클로라
이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 함께 다공성 중합체
매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 실활 알루미나, 규조토, MgS04, 또는 다른 무기 미분 물질,
천연 직물 (예를 들어 면) 및 합성 직물 (예를 들어 나일론 또는 레이온), 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아
가로스, 덱스트란 및 젤라틴, 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 특정 실시태양에서, 다공성 막 (23)은 니트로셀룰로스 및(또는) 폴리에스테르 술폰 물질로 형성된다. 용어
"니트로셀룰로스"는 셀룰로스의 질산 에스테르를 의미하고, 니트로셀룰로스 단독 또는 질산 및 다른 산, 예를
들어 탄소수 1 내지 7의 지방족 카르복실산의 혼합 에스테르일 수 있음을 이해하여야 한다.
장치 (20)은 또한 위킹 패드 (28)을 포함할 수 있다. 위킹 패드 (28)은 일반적으로 전체 다공성 막 (23)을 통[0046]
해 이동하는 유체를 수용한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 위킹 패드 (28)은 막 (23)을 통한 모세관
작용 및 유체 유동 촉진을 도울 수 있다.
시험 샘플 내의 분석물의 검출을 개시하기 위해서, 사용자는 시험 샘플을 그를 통해 이동할 수 있는 다공성 막[0047]
(23)의 일부에 직접 적용할 수 있다. 별법으로, 시험 샘플을 다공성 막 (23)에 유체가 통과할 수 있는 샘플링
패드 (도시하지 않음)에 먼저 적용할 수 있다. 샘플링 패드 형성에 사용될 수 있는 몇몇 적합한 물질은 니트로
셀룰로스, 셀룰로스, 다공성 폴리에틸렌 패드 및 유리 섬유 여과지를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 필요한
경우, 샘플링 패드는 또한 확산 또는 비확산에 의해 부착된 하나 이상의 분석 전처리 시약을 포함할 수도 있다.
예시된 실시태양에서, 시험 샘플은 샘플링 패드 (도시하지 않음)로부터 샘플링 패드의 한 말단에 유체가 통과[0048]
할 수 있게 배치된 컨쥬게이트 패드 (22)로 이동한다. 컨쥬게이트 패드 (22)는 시험 샘플이 그를 통과할 수 있
는 물질로 형성된다. 예를 들어, 한 실시태양에서 컨쥬게이트 패드 (22)는 유리 섬유로 형성된다. 단지 하나
의 컨쥬게이트 패드 (22)가 도시되었지만, 다른 컨쥬게이트 패드도 본 발명에 사용할 수 있음을 이해하여야 한
다.
시험 샘플 내의 분석물의 존재 또는 부재의 정확한 검출을 용이하게 하기 위해, 표지들을 장치 (20)의 여러 위[0049]
치에 적용한다. 표지들은 분석물의 검출 및 교정 모두를 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 장치 (20)에 사용
되는 표지의 적어도 일부가 형광 화합물을 함유한다. 일반적으로, 그러한 형광 화합물들은 형광 분자, 중합체,
덴드리머, 입자 등일 수 있다.
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본 발명에 따르면, 형광 표지는 "시분해 형광 검출"이 가능하도록 구성된다. 시분해 형광은 짧은 광 펄스로 형[0050]
광 표지를 여기시키고, 나머지 긴 수명의 형광 신호를 측정하기 전에 통상적으로 여기 후 일정 시간 (예컨대,
약 100 내지 200 마이크로초) 기다리는 것을 포함한다. 이런 방식에서, 임의의 짧은 수명의 형광 배경 신호 및
산란된 여기 방사선이 제거된다. 많은 배경 신호를 제거하는 이런 능력은 통상적인 형광보다 2 내지 4 차수 더
큰 감도를 가져올 수 있다. 따라서, 시분해 형광 검출은 특정 형광 물질의 형광 특성을 이용함으로써 방출원
또는 산란 과정 (여기 방사선의 산란으로 인함)으로부터의 배경 신호를 감소시키도록 고안된다.
시분해 형광을 위한 특히 바람직한 표지의 선택 기준은 비교적 긴 방출 수명을 포함한다. 상기 언급한 바와 같[0051]
이, 이는 임의의 짧은 수명 배경 신호가 소산된 충분한 이후에 표지가 그의 신호를 방출하도록 하는데
요구된다. 더욱이, 긴 형광 수명은 시간 게이트 형광 측정용으로 저가의 회로를 이용하는 것을 가능하게 한다.
예를 들어, 본 발명에서 사용되는 형광 표지는 약 1 마이크로초를 넘고, 일부 실시태양에서는 약 10 마이크로초
를 초과하며, 일부 실시태양에서는 약 50 마이크로초를 초과하고, 일부 실시태양에서는 약 100 마이크로초 내지
약 1000 마이크로초의 형광 수명을 가질 수 있다. 또한, 형광 표지는 비교적 큰 "스토크스 이동"을 가질 수도
있다. "스토크스 이동"이란 용어는 일반적으로 여기선 또는 여기띠보다 긴 방출 파장으로 발광 방사선의 스펙
트럼선 또는 띠가 이동하는 것으로 정의된다. 비교적 큰 스토크스 이동은 형광 표지의 여기 파장이 그의 방출
파장에서 멀리 떨어져 유지되게 하고, 여기 및 방출 파장간의 큰 차는 방출된 신호로부터 반사된 여기 방사선을
제거하는 것을 용이하게 하므로 바람직하다. 더욱이, 큰 스토크스 이동은 또한 샘플 내의 형광 분자로부터의
방해 및/또는 일부 체액 (예컨대 혈액)의 경우 존재하는 단백질 또는 콜로이드에서 기인하는 빛 산란을 최소화
한다. 또한, 큰 스토크스 이동은 또한 배경 방해를 제거하기 위해 고가의 고정밀 필터를 사용할 필요가 없다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 형광 표지는 약 50 나노미터를 초과하고, 일부 실시태양에서는 100 나노미터를
초과하며, 일부 실시태양에서는 약 250 내지 약 350 나노미터의 스토크스 이동을 갖는다.
비교적 긴 방출 수명과 비교적 큰 스토크스 이동을 모두 갖는 한 유형의 형광 화합물의 한 유형은 사마륨[0052]
(Sm(III)), 디스프로슘 (Dy(III)), 유러퓸 (Eu(III)), 및 테르븀 (Tb(III))의 란탄족 킬레이트들이다. 그러한
킬레이트는 충분히 짧은 파장에서 킬레이트의 여기 후에, 좁은띠, 긴 수명의 강하게 적색 이동된 방출을 나타낼
수 있다. 일반적으로 킬레이트는 분자 내에서 란탄족 가까이에 위치한 발색단으로 인해 강한 자외선 여기띠를
보유한다. 발색단에 의한 여기에 이어서, 여기 에너지는 여기된 발색단에서 란탄족으로 전달될 수 있다. 그
다음에 란탄족의 형광 방출 특성이 나타난다. 예를 들어, 유러퓸 킬레이트는 플루오레세인에 대한 단지 약 28
나노미터의 스토크스 이동에 비하여 약 250 내지 약 350 나노미터의 예외적으로 큰 스토크스 이동을 갖는다.
또한 유러퓸 킬레이트의 형광은 다른 형광 표지에 있어서의 약 1 내지 약 100 나노초 수명에 비해 약 100 내지
약 1000 마이크로초의 긴 수명을 갖는다. 또한, 이들 킬레이트는 전형적으로 약 50% 방출에서 약 10 나노미터
미만의 띠폭을 갖는 매우 좁은 방출 스펙트럼을 갖는다. 적절한 유러퓸 킬레이트의 하나는 N-(p-이소티오시아
나토벤질)-디에틸렌 트리아민 테트라아세트산-Eu
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이다.
또한, 수용액 또는 현탁액에서 불활성이고 안정하며 본질적으로 형광인 란탄족 킬레이트 역시, 수용액 또는 현[0053]
탁액에서 제한된 용해도 및 켄칭 문제를 갖는 킬레이트를 보호하는데 종종 이용되는 미셀-형성제에 대한 필요를
없애기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러한 킬레이트의 한가지 예는 4-[2-(4-이소티오시아나토페닐)에티
닐]-2,6-비스([N,N-비스(카르복시메틸)아미노]메틸)-피리딘이다 [참고문헌: Lovgren, T., et al.; Clin. Chem.
42, 1196-1201 (1996)]. 몇 가지 란탄족 킬레이트 또한 예외적으로 높은 신호 대 노이즈 비를 보인다. 예를
들어, 그러한 한가지 킬레이트는 네자리 β-디케토네이트-유러퓸 킬레이트이다 [참고문헌: Yuan, J. and
Matsumoto, K.; Anal. Chem. 70,596-601(1998)]. 앞서 기술된 형광 표지 외에, 본 발명에서의 이용에 적당한
다른 표지들이 미국 특허 제6,030,840호 (물리낵스 (Mullinax) 외)), 제5,585,279호 (데이비슨 (Davidson)),
제5,573,909호 (싱어 (Singer) 외), 제6,242,268호 (위더 (Wieder) 외) 및 제5,637,509호 (헴미라 (Hemmila)
외)에서 기술되었을 수 있는데, 이들은 모든 목적을 위해 본원에 참고문헌으로서 그 자체로 포함된다.
형광 표지는 프로브를 형성하기 위해 다양한 방법으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 표지는 프로브를 형성하기[0054]
위해 단독으로 사용될 수 있다. 별법으로, 표지들은 프로브를 형성하기 위해 중합체, 리포솜, 덴드리머 및 기
타 마이크로- 또는 나노-크기 구조와 연결하여 사용할 수 있다. 또한 표지들은 마이크로입자 (종종 "비드" 또
는 "마이크로비드"로 부름)와 연결하여 사용되어 프로브를 형성할 수 있다. 예를 들어, 천연적으로 생성되는
마이크로입자, 가령 핵, 미코플라스마, 플라스미드, 플라스티드, 포유류 세포 (예컨데, 에리트로사이트 고스
트), 단세포 미생물 (예컨대 박테리아), 다당류 (예컨대 아가로우즈), 실리카, 유리, 셀룰로스 기재 입자 등이
이용될 수 있다. 또한, 합성 마이크로입자 역시 이용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서 형광 또는 착색
염료로 표지된 라텍스 마이크로입자를 이용한다. 본 발명에서 임의의 라텍스 마이크로입자가 사용될 수
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있지만, 라텍스 마이크로입자는 일반적으로 폴리스티렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼원공중합체, 폴
리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비
닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐클로라이드-아크릴레이트 등, 또는
이들의 알데히드, 카르복실, 아미노, 히드록실 또는 히드라지드 유도체이다. 다른 적당한 마이크로입자가 미국
특허 제5,670,381호 (조우 (Jou) 외) 및 제5,252,459호 (Tarcha(타르차) 외)에서 기술될 수 있고, 이들은 모든
목적을 위해 그 전체로서 참고문헌으로 본원에 포함된다.
일부 실시태양에서 마이크로입자는 자성일 수 있다. 일반적으로, 물질은 자기장의 인가에 의해 영향받을 경우,[0055]
예를 들어 유인되거나 배척되거나 또는 검출가능한 자기 민감성 또는 유도성을 갖는 경우에 "자성"인 것으로 간
주된다. 예를 들어, 프로브에 자기 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있는 적합한 자기 반응성 물질의 몇몇 예
는 상자성 물질, 초상자성 물질, 강자성 물질, 준강자성 물질 및 준자성 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는
다. 구체적인 예는 금속, 예를 들어 철, 니켈, 코발트, 크롬, 망간 등, 란탄족 원소, 예를 들어 네오디뮴, 에
르븀 등, 합금, 예를 들어 알루미늄, 니켈, 코발트, 구리 등의 자기 합금, 산화물, 예를 들어 산화제2철
(Fe304), 산화제1철 (Fe203), 산화크롬 (Cr02), 산화코발트 (CoO), 산화니켈 (Ni02), 산화망간 (Mn203) 등, 복합
물질, 예를 들어 페라이트 등, 및 고체 용액, 예를 들어 산화제2철을 갖는 마그네타이트 등이다.
앞서 기술한 것과 같은 입자들을 이용하는 경우, 입자의 평균 직경은 일반적으로 여러 요인, 예를 들어 선택된[0056]
입자 종류, 막의 공극 크기 및 막 조성에 따라 요구되는 바와 같이 변할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에
서, 입자 프로브의 평균 직경은 약 0.01 미크론 내지 약 1,000 미크론, 일부 실시태양에서 약 0.01 미크론 내지
약 100 미크론, 일부 실시태양에서 약 0.01 미크론 내지 약 10 미크론일 수 있다. 한 특정 실시태양에서, 입자
프로브의 평균 직경은 약 1 내지 약 2 미크론이다. 일반적으로, 입자는 실질적으로 구형이지만, 판형, 막대형,
바형, 불규칙 형태 등을 포함하여 다른 형태도 본 발명에 사용하기 적합하다. 당업자가 이해할 수 있는 바와
같이, 입자의 조성, 형태, 크기 및(또는) 밀도는 크게 상이할 수 있다.
일부 예에서, 프로브를 어떤 방식으로 변형하여 더 쉽게 분석물에 결합하게 하는 것이 바람직하다. 그러한 예[0057]
에서, 프로브는 부착되어 접합 프로브를 형성하는 특정의 특이적 결합원으로 변형될 수 있다. 특이적 결합원은
일반적으로 특이적 결합쌍, 즉, 한 분자가 다른 분자에 화학적으로 및/또는 물리적으로 결합하는 2개의 상이한
분자의 구성원을 의미한다. 예를 들어, 면역반응성 특이적 결합원은 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성법에 의
해 형성된 것을 포함하여 항원, 합텐, 앱타머 (aptamer), 항체 및 이들의 복합체를 포함할 수 있다. 항체는 모
노클로날 또는 폴리클로날 항체, 재조합 단백질 또는 이들의 혼합물(들) 또는 이들의 단편(들), 및 항체와 다른
특이적 결합 성분의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 항체의 제조 및 특이적 결합 성분으로서 사용하기 위한 적
합성의 상세한 내용은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 다른 통상적인 특이적 결합쌍은 비오틴 및 아비딘,
비오틴 및 스트렙트아비딘, 항체-결합 단백질 (단백질 A 또는 G 등) 및 항체, 탄수화물 및 렉틴, 상보성 뉴클레
오티드 서열 (표적 핵산 서열을 검출하기 위한 DNA 혼성화 분석에 사용되는 표지 및 포획 핵산 서열 포함) 및
재조합 방법에 의해 형성되는 것을 포함하는 상보성 펩티드 서열, 이펙터 및 수용체 분자, 호르몬 및 호르몬 결
합 단백질, 효소 코팩터 및 효소, 효소 저해제 및 효소 등을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 특이적
결합쌍은 본래의 특이적 결합원의 유사체인 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석물의 유도체 또는 단편,
즉 분석물-유사체는 분석물과 공통적인 적어도 하나의 에피토프를 갖는 한 사용될 수 있다.
특이적 결합원은 일반적으로 임의의 다양한 공지 기술을 사용하여 프로브에 부착될 수 있다. 예를 들어, 특이[0058]
적 결합원의 프로브 (예를 들어 표지화된 마이크로입자)에 대한 공유 결합에 의한 부착은 카르복실기,
아미노기, 알데히드기, 브로모아세틸기, 요오도아세틸기, 티올기, 에폭시기 및 다른 반응성 또는 연결 관능기,
및 그를 통해 단백질 커플링 반응을 수행할 수 있는 잔류 유리 라디칼 및 라디칼 양이온을 사용하여 달성할 수
있다. 또한, 마이크로입자의 표면은 비교적 높은 표면 농도의 극성기를 포함할 수 있기 때문에 표면 관능기가
관능화된 공단량체로서 도입될 수도 있다. 또한, 특정 경우, 예를 들어 폴리(티오페놀)의 경우에 마이크로입자
표지가 합성 후에 종종 관능화되기 때문에 마이크로입자는 추가로 변형할 필요없이 단백질과 직접 공유 결합할
수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서 접합의 제1 단계는 카르보디이미드를 사용하여 입자 표면 상에서 카르복
실기를 활성화하는 것이다. 제2 단계에서, 활성화된 카르복실산기는 항체의 아미노기와 반응하여 아미드 결합
을 형성한다. 활성화 및/또는 항체 커플링은 완충액, 예를 들어 포스페이트-완충 염수 (PBS) (예를 들어, pH
7.2) 또는 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산 (MES) (예를 들어, pH 5.3)에서 발생할 수 있다. 도시된 바와 같이,
생성되는 프로브는 이어서 예를 들어 에탄올아민으로 차단하여 표지 접합체를 형성할 수 있다. 공유결합 이외
에, 다른 부착 기술, 예를 들어 흡착도 본 발명에서 사용할 수 있다.
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일반적으로, 다양한 유통 분석 장치가 시분해 형광 검출 시스템과 함께 이용하기 위해 본 발명에 따라 구성될[0059]
수 있다. 이와 관련하여, 여러가지 본 발명의 실시태양이 이제 더 상세히 기술될 것이다. 그러나 아래 기술되
는 실시태양들은 단지 예시적인 것이며 다른 실시태양들 역시 본 발명에 의해 고려될 수 있음을 이해해야 한다.
예를 들어, 다시 도 1을 참조하면, 시험 샘플 내의 분석물의 존재를 검출하는 하나의 시스템이 도식적으로 묘사
되어 있다. 처음에는, 분석물을 함유하는 시험 샘플을 샘플링 패드 (나타나 있지 않음)에 적용한다. 그후 테
스트 샘플이 샘플링 패드로부터 컨쥬게이트 패드 (22)로 이동하는데, 여기서 분석물이 프로브와 혼합되어 분석
물 복합체를 형성한다. 일 실시태양에서, 예컨대 프로브는 상기 기술한 것과 같은 란탄족 킬레이트 표지로 염
색되고 관심 분석물에 대한 특이적 결합원과 결합된 마이크로입자로부터 형성된다. 더욱이, 컨쥬게이트 패드
(22)는 다공성 막 (23)에 유체가 통과할 수 있으므로, 복합체가 컨쥬게이트 패드 (22)에서 다공성 막 (23) 상에
존재하는 검출 구역 (31)로 이동할 수 있다.
검출 구역 (31)은 일반적으로 프로브와 화학적 또는 물리적 결합을 할 수 있는 고정화된 포획제를 함유할 수 있[0060]
다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 결합제는 생물학적 포획제를 함유할 수 있다. 그러한 생물학적 포획제는
당해 기술분야에 공지되어 있고, 항원, 합텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙트아비딘, 2차 항체 및 이
들의 착물을 포함한다 (이에 한정되지는 않음). 많은 경우에서, 이들 생물학적 포획제가 마이크로입자 상에 존
재하는 특이적 결합원 (예컨대 항체)에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 결합제로 다양한 비생물학적
물질을 이용하는 것 역시 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 결합제는 비포획 프로브에 결합할
수 있는 고분자전해질을 포함할 수 있다. 고분자전해질은 일반적으로 중성인 알짜 전하 뿐만 아니라, 알짜 양
전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 예를 들어, 알짜 양전하를 갖는 고분자전해질의 일부 적당한 예는 폴리리신
(미조리주 세인트 루이스의 시그마-알드리치 케미칼 코. 인크. (Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc.)에서 시판
됨), 폴리에틸렌이민; 에피클로로히드린-관능성 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민, 예컨대 폴리(디메틸아민-co-
에피클로로히드린); 폴리디알릴디메틸-암모늄 클로라이드; 양이온성 셀룰로스 유도체, 예컨대 4차 암모늄 수용
성 단량체로 그래프트된 셀룰로스 공중합체 또는 셀룰로스 유도체 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특
별한 하나의 실시태양에서, 4차 암모늄 수용성 단량체를 함유하는 셀룰로스 유도체인 CelQuat (등록상표) SC-
230M 또는 H-100 (내쇼날 스타치

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