(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(45) 공고일자 2016년03월29일
(11) 등록번호 10-1606112
(24) 등록일자 2016년03월18일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
A61K 47/34 (2006.01) A61K 31/704 (2006.01)
(52) CPC특허분류
A61K 47/34 (2013.01)
A61K 31/704 (2013.01)
(21) 출원번호 10-2015-0033032
(22) 출원일자 2015년03월10일
심사청구일자 2015년03월10일
(56) 선행기술조사문헌
논문1: Soft Matter.
(73) 특허권자
가톨릭대학교 산학협력단
서울특별시 서초구 반포대로 222, 가톨릭대학교
성의교정내 (반포동)
재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발
공동연구소
인천광역시 연수구 송도미래로 9(송도동)
(72) 발명자
강한창
서울특별시 송파구 올림픽로33길 17, 4동 309호(
신천동, 미성아파트)
이돈행
서울 양천구 목동동로 411, A동 1214호 (목동, 부
영그린타운3차)
(뒷면에 계속)
(74) 대리인
특허법인태백
전체 청구항 수 : 총 5 항 심사관 : 이수형
(54) 발명의 명칭 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 블록공중합체 및 상기 블록공중합체를 이용한 나노약물전달용 조성물
(57) 요 약
본 발명은 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl ether; mPEG)-b-이황화결합을 가진 환원
분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing reducible poly(ε-caprolactone); RSPCL]-b-mPEG 블록
공중합체 및 상기 블록공중합체를 이용한 나노약물전달용 조성물에 관한 것으로서, 합성된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG
블록공중합체는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 다양한 약물을 세포 내로 전달할 수 있는 전
달체로의 역할도 할 수 있다.
대 표 도 - 도1
등록특허 10-1606112
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(52) CPC특허분류
A61K 47/488 (2013.01)
A61K 9/1075 (2013.01)
(72) 발명자
허강무
대전 유성구 어은로 57, 131동 1503호 (어은동, 한
빛아파트)
문승연
충남 천안시 동남구 순천향1길 16, 103동 1005호
(쌍용동, 쌍용신성아파트)
공지예외적용 : 있음
등록특허 10-1606112
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명 세 서
청구범위
청구항 1
다중 이황화결합을 가진 환원분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing reducible poly(ε-
caprolactone); RSPCL]의 양 말단에 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl ether; mPEG)
가 결합된, 화학식 1로 표시되는 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-RSPCL) 블록공중합체.
<화학식 1>
x는 3 내지 20이고, y는 2 내지 50이며, z는 10 내지 200임.
청구항 2
제1항의 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 블록공중합체가 수상에서 자기조립된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자.
청구항 3
제2항의 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물.
청구항 4
제3항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.
청구항 5
제4항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신인 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl ether; mPEG)-b-이황화결합을 가진 환원[0001]
분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing reducible poly(ε-caprolactone); RSPCL]-b-mPEG 블록
공중합체 및 상기 블록공중합체를 이용한 나노약물전달용 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
친수성과 소수성 부분으로 구성된 양친매성 공중합체는 수상환경에서 친수성 블록과 소수성 블록의 비율에 따라[0002]
다양한 나노구조(구형 마이셀, 원통형 마이셀, 평면 이중층, 폴리머좀, 역마이셀)를 형성하기 위해 자발적으로
자기조립 될 수 있다. 마이셀 나노구조체는 소수성 화학약물을 봉입하기 위한 소수성 내부 공간을 가지고 있는
반면, 폴리머좀은 이중층 쉘의 소수성 부분과 이중층 쉘에 의해 외부로부터 분리된 친수성 내부 공간에 각각 소
수성 약물과 친수성 약물을 모두 봉입할 수 있다. 이러한 나노구조와 봉입할 수 있는 약물의 다양성은 공중합체
를 이용한 약물전달체로서의 응용에 대한 관심이 지속적으로 증가하고 있다.
양친매성 공중합체의 임상적 응용과 약물효과의 증진을 위해 세포적합성, 생분해성, 자극 반응성 약물 방출과[0003]
같은 다양한 기능들이 공중합체에 부가되어지고 있다. 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG)은
무독성, 비면역원성, 비항원성, 비종양성을 포함한 우수한 세포적합성을 나타내며, 단백질 흡착, 혈액응고, 보
체활성과 같은 혈액 구성성분과의 비특이적 상호작용을 막아주기 때문에 대부분의 양친매성 공중합체의 친수성
블록으로 사용되고 있다. 또한, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리카프로락톤 (poly(ε-
등록특허 10-1606112
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caprolactone), PCL), 폴리젖산 (poly(lactic acid), PLA), 폴리(젖산-글리콜산) 중합체 (poly(lactic-co-
glycolic acid), PLGA)와 같은 폴리에스터는 생체 내에서 가수분해 및 효소분해 될 수 있는 우수한 생체적합성
을 나타내기 때문에 소수성 블록으로 광범위하게 사용되고 있다.
폴리에틸렌글리콜-폴리에스터를 기본으로 한 나노구조체에서 폴리에스터의 가수분해성은 약물의 작용기관에서[0004]
약물의 빠른 방출을 유도하기 어렵다. 따라서, pH, 효소, 글루타치온(glutathione, GSH) 등과 같은 세포내 자극
에 특이적으로 반응하는 화학결합 또는 구성요소가 폴리에틸렌글리콜-폴리에스터 공중합체에 첨가되어 세포내
환경에서 빠른 약물방출을 촉진할 수 있다. 그러나, 약산성 pH 조건은 세포 밖의 고형 종양 주변부와 감염 부위
와 같은 병리적 환경 뿐만 아니라 세포 안의 엔도솜(endosome) 및 리소솜(lysosome) 내부의 pH 환경을 명확하게
구분하기 어려운 단점을 가진다. 또한, 리소솜에 존재하는 다양한 효소에 의해 나노약물전달체로부터 약물방출
이 촉진될 수 있으나 방출된 약물이 리소솜을 탈출하지 못하면 분해효소에 의한 약물의 분해로 인한 치료효과의
감소가 나타날 수 있다.
최근, 많은 연구자들은 생물학적 치올(~SH, thiol)인 글루타치온의 세포 밖 농도가 0.02~2μM, 세포 내의 세포[0005]
질 및 핵 내의 농도가 1~11mM이고, 이황화결합(~S-S~)과 치올(~SH)간의 전환반응에 주목하고 있다. pH, 효소와
달리, 세포 밖 환경과 세포 내 환경에서의 글루타치온의 농도 차이는 세포 밖의 환경에서는 나노약물전달체가
안정하여 봉입된 약물을 최대한 손실 없이 세포 내로 전달하게 해주고, 세포 내에서는 존재하는 글루타치온에
의해 나노약물전달체 내에 존재하는 이황화결합이 끊어져 치올기로 전환되면 빠른 약물 방출을 야기할 수 있다
고 생각하고 있다.
실제로, 중국의 Zhong 연구팀은 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 친수성 고분자 블록과 폴리카프로락톤(PCL)의 소수성[0006]
고분자 블록을 이황화결합으로 연결하여 PEG-SS-PCL 이중합체(diblock copolymer)를 합성하였고, 이를 이용하여
소수성 독소루비신(doxorubicin, DOX) 약물이 봉입된 무독성 환원반응성(reduction-responsive) 마이셀을 제조
하였다. DOX 봉입 환원반응성 마이셀은 환원에 무반응인 마이셀보다 환원환경 하에서 DOX의 빠른 방출을
보였다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 0001) 중국공개특허 제102085117호(2011.06.08) [0007]
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 목적은 다중 이황화결합을 가진 환원분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing[0008]
reducible poly(ε-caprolactone); RSPCL]의 양 말단에 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol
methyl ether; mPEG)가 결합된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-RSPCL) 블록공중합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 고분자가 수상에서 자기조립된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입[0009]
자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공하는데 있다.
과제의 해결 수단
이에, 상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 다중 이황화결합을 가진 환원분해성 폴리(입실론-카프로락[0010]
톤)[disulfide-containing reducible poly(ε-caprolactone); RSPCL]의 양 말단에 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테
르(polyethylene glycol methyl ether; mPEG)가 결합된, 화학식 1로 표시되는 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-
RSPCL) 블록공중합체를 제공한다.
등록특허 10-1606112
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<화학식 1>[0011]
[0012]
x는 3 내지 20이고, y는 2 내지 50이며, z는 10 내지 200임.[0013]
또한, 본 발명은 상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 블록공중합체가 수상에서 자기조립된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입[0014]
자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한[0015]
다.
발명의 효과
본 발명은 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl ether; mPEG)-b-이황화결합을 가진 환원[0016]
분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing reducible poly(ε-caprolactone); RSPCL]-b-mPEG 블록
공중합체 및 상기 블록공중합체를 이용한 나노약물전달용 조성물에 관한 것으로서, 합성된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG
블록공중합체는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 다양한 약물을 세포 내로 전달할 수 있는 전
달체로의 역할도 할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-RSPCL) 블록공중합체 합성과정을 나타낸다.[0017]
도 2는 RSPCL0.5 고분자와 mPEG-RSPCL0.5 블록공중합체의
1
H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 RSPCL1.2 고분자와 mPEG-RSPCL1.2 블록공중합체의
1
H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 RSPCL0.5 고분자와 mPEG-RSPCL0.5 블록공중합체의 GPC 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 RSPCL1.2 고분자와 mPEG-RSPCL1.2 블록공중합체의 GPC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 치올 등의 환원조건 하에서 mPEG-RSPCL 나노입자의 시간에 따른 입자크기 변화를 나타낸다.
도 7은 치올 등의 환원조건 하에서 mPEG-RSPCL 나노입자의 구성물질인 mPEG-RSPCL 고분자의 시간에 따른 수평균
분자량 변화를 나타낸다.
도 8은 HeLa 세포를 이용한 약물봉입 mPEG-RSPCL 나노입자의 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 9는 HepG2 세포를 이용한 약물봉입 mPEG-RSPCL 나노입자의 항암특성 평가결과를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명자들은 PEG와 PCL을 이용한 양친매성 블록 공중합체를 합성하였으며, 이황화결합을 두 고분자 블록 사이[0018]
에 도입했을 뿐만 아니라, 소수성 고분자 블록 내에도 도입시켰다. 즉, 다중 이황화결합은 PEG 블록을 고분자량
(high molecular weight, HMW) 환원성 PCL 고분자 블록 (RSPCL)의 양 말단과 연결시킬 때, 뿐만 아니라 HMW
RSPCL 고분자 블록을 형성하는 여러 개의 저분자량(low molecular weight, LMW) PCL을 서로 연결할 때도 사용
하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 다중 이황화결합을 가진 환원분해성 폴리(입실론-카프로락톤)[disulfide-containing reducible[0019]
poly(ε-caprolactone); RSPCL]의 양 말단에 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl
ether; mPEG)가 결합된, 화학식 1로 표시되는 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-RSPCL) 블록공중합체를 제공한다.
등록특허 10-1606112
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<화학식 1>[0020]
[0021]
x는 3 내지 20이고, y는 2 내지 50이며, z는 10 내지 200임.[0022]
또한, 본 발명은 상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 블록공중합체가 수상에서 자기조립된 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입[0023]
자를 제공한다.
상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.[0024]
mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 블록공중합체를 DMSO에 녹인 후, 고분자 용액을 교반하면서 정제수를 첨가한다. mPEG-b-[0025]
RSPCL-b-mPEG 블록공중합체는 물과 만나 자기조립되어 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자를 형성한다. mPEG-b-
RSPCL-b-mPEG 나노입자가 포함된 분산액을 투석막에 넣어 수상에서 투석을 통해 DMSO를 제거한다. 투석막 안에
남은 분산액을 0.45 μm 공극을 갖는 주사기용 필터로 여과한 후, 최종적으로 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자를
얻었다.
또한, 본 발명은 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한다.[0026]
바람직하게는, 상기 약물은 항암제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 항암제
는 독소루비신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 mPEG-b-RSPCL-b-mPEG 자기조립 나노입자는 수용성 화학약물 및 수불용성 화학약물을 담지할 수 있어 나노[0027]
약물전달체로 응용가능하다. 친수성 항암제인 독소루비신 염화염 (doxorubicin HCl)을 봉입한 mPEG-b-RSPCL-b-
mPEG 자기조립 나노입자는 독소루비신 염화염보다 암세포 실험에서 약 2~4배 우수한 항암효과 (in vitro anti-
tumor effect)을 나타냈다.
본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적[0028]
으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물
또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기
약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변
화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애,[0029]
현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석
제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아
고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈,
물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수
있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수[0030]
있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히
선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지
의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 “약물”은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하[0031]
등록특허 10-1606112
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는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는
생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에
대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또
는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는[0032]
것은 아니다.
<실시예 1> mPEG-b-RSPCL-b-mPEG (mPEG-RSPCL) 블록공중합체 합성 및 분석[0033]
도 1에서 나타낸 바와 같이, 1mmol의 폴리카프로락톤디올(PCL diol)과 1.5mmol의 3,3’-디티오디프로피온산(3,3[0034]
’-dithiodipropionic acid; DTPA)을 10mL의 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 녹인 용액에 디사이
클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide; DCC)와 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine;
DMAP) 각각 3.6mmol이 녹여진 5mL의 THF 용액을 점적하였다. 추가적으로 위 고분자 반응용액에 0.2mL의 트리에
틸아민(triethylamine, TEA)을 첨가한 후, 질소 충전하에서 2일 동안 상온반응시킨다. 반응 종료 후, 여과지를
이용해 생성된 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea; DCU)를 제거하고, 용매인 THF를 회전농축증발
기(rotary evaporator)를 이용해 제거했다. 건조된 생성물을 디클로로메탄(dichloromethane; DCM)에 다시
녹여, 노르말 헥산(n-hexane)에 침전시켜 후, 침전물을 진공 건조하여 고분자량의 RSPCL 고분자를 얻었다.
0.05mmol의 합성된 RSPCL 고분자와 0.12mmol의 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르(polyethylene glycol methyl[0035]
ether, mPEG)를 15mL의 클로로포름(chloroform)에 용해시킨 후, 이 용액에 5mL의 클로로포름(chloroform)에
0.144 mmol의 DCC와 0.144 mmol의 DMAP을 녹인 용액을 점적한다. 추가적으로 위 고분자 반응용액에 0.04mL의
트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 첨가한 후, 질소 충전하에서 2일 동안 상온반응시킨다. 반응 종료 후, 여
과지를 이용해 생성된 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea; DCU)를 제거하고, 여과액을 에테르에
점적한다. 침전물을 여과지에 걸러낸 후, 메탄올로 침전물에 남아있는 미반응 mPEG를 제거하고 진공
건조하였다. 건조된 생성물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 투석막에 넣어 수상에서
2일 동안 투석을 한다. 투석막 안에 남은 용액을 0.45 μm 공극을 갖는 주사기용 필터를 이용해 여과한 후, 동
결 건조하여 최종적으로 mPEG-RSPCL 블록 공중합체를 얻었다.
도 2 및 도 3에서 보이는 바와 같이,
1
H-NMR을 이용하여 mPEG-RSPCL 블록 공중합체의 화학구조를 확인하였고,[0036]
RSPCL의 양 말단에 결합한 mPEG의 수가 약 1.7~1.8개이므로 mPEG-RSPCL-mPEG 형태의 트리블록 공중합체임을 확
인하였다. 또한, 도 4와 도 5의 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)분석을 통해
RSPCL 고분자와 PEG-RSPCL 공중합체의 수평균분자량이 각각 약 9,310Da과 19,830Da임을 확인하였다.
<실시예 2> mPEG-RSPCL 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성[0037]
mPEG-RSPCL 나노입자를 제조하기 위해 mPEG-RSPCL 고분자를 DMSO에 녹인 후, 고분자 용액을 교반하면서 정제수[0038]
를 첨가한다. mPEG-RSPCL 고분자는 물과 만나 자기조립되어 mPEG-RSPCL 나노입자를 형성한다. mPEG-RSPCL 나노
입자가 포함된 분산액을 투석막에 넣어 수상에서 투석을 통해 DMSO를 제거한다. 투석막 안에 남은 분산액을
0.45 μm 공극을 갖는 주사기용 필터로 여과한 후, 최종적으로 mPEG-RSPCL 나노입자를 얻었다. mPEG-RSPCL 나노
입자는 100 nm 이하의 크기를 가지며, -1~-2 mV 정도의 제타전위를 나타냈다.
환원 조건하에서 mPEG-RSPCL 나노입자의 입자크기 변화와 나노입자의 구성물질인 PEG-RSPCL 고분자의 분자량 변[0039]
화를 확인하기 위해 mPEG-RSPCL 나노입자가 포함된 pH 7.4 인산완충액에 디티오트레이톨(DL-dithiothreitol,
DTT) 넣어 10mM이 되도록 했다. 도 6에서 보는 바와 같이, DTT에 노출 전에 mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 크기는 약
60 nm이었으나, DTT에 노출 후, 30분 만에 약 500nm로, 1시간에는 약 850nm로, 2시간에는 약 1,100nm로
커졌다. 또한, 나노입자의 구성물질인 mPEG-RSPCL의 분자량 변화를 분석하기 위해 나노입자가 포함된 분산액을
동결건조한 후, HPLC용 THF에 녹였다. 주사기용 필터로 염을 제거한 후, 여과액에 녹아있는 mPEG-RSPCL 고분자
분해산물의 분자량을 GPC를 통해 측정했다. 도 7에서 보는 바와 같이, mPEG-RSPCL1.2 및 mPEG-RSPCL0.5 고분자의
수평균분자량은 각각 18,590Da과 28,620Da에서 DTT 노출 30분만에 각각 3,870Da과 1,810Da으로 변했다. 이 평
등록특허 10-1606112
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균분자량은 PEG-RSPCL 고분자가 완전히 분해되었을 때, 생성될 수 있는 mPEG와 PCL의 혼합물로부터 얻어진 것으
로 보인다. 따라서, mPEG-RSPCL 고분자는 치올 등의 환원 조건에서 분해될 수 있다.
<실시예 3> 독소루비신 항암제가 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성[0040]
독소루비신 염화염(doxorubicin hydrochloride, DOXHCl)을 mPEG-RSPCL 나노입자에 봉입시키기 위해 황산암모늄[0041]
(ammonium sulfate)의 농도구배를 이용하였다. 2mg의 mPEG-RSPCL 고분자를 0.1mL의 DMSO에 녹인 후, 이 고분자
용액에 3.5 mL의 정제수를 첨가해 PEG-RSPCL 나노입자를 만든 후, 수상에서 투석을 이용해 DMSO를 제거한다.
mPEG-RSPCL 나노입자를 포함하는 분산액에 황산암모늄 분말을 첨가해 분산액의 황산암모늄 농도가 250mM이 되도
록 하고, 이를 3시간 동안 교반한다. 이 분산액을 투석막 안에 넣고 수상에서 투석을 통해 mPEG-RSPCL 나노입자
밖에 존재하는 황산암모늄을 제거한다. 황산암모늄이 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자에 0.22mg의 DOX·HCl를 첨가
한 후, 60
o
C에서 2시간 동안 교반하였다. 4℃ 수상에서 투석을 통해 mPEG-RSPCL 나노입자 내에 봉입되지 않은
DOX·HCl을 제거한다. 제조된 DOX·HCl-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX·HCl-mPEG-RSPCL1.2 나노입자는 각각 약
117 ± 21nm와 98 ± 20nm 크기를 가지며, 이들의 제타전위는 각각 1.4 ± 5.8mV와 1.7 ± 1.3mV이었다. 약물
의 목표 무게함량을 10wt%으로 해서 DOX·HCl을 mPEG-RSPCL 나노입자 내부에 봉입했을 때, DOX·HCl-mPEG-
RSPCL0.5 나노입자의 실제 무게함량은 3.0 ± 0.6wt%, 약물 봉입효율은 30 ± 5.8%이었고, DOX·HCl-mPEG-
RSPCL1.2 나노입자의 실제 무게함량은 4.2 ± 0.6wt%, 약물 봉입효율은 42 ± 6.4%이었다.
독소루비신(doxorubicin, DOX)을 PEG-RSPCL 나노입자에 봉입시키기 위해 독소루비신 염화염(doxorubicin[0042]
hydrochloride, DOX·HCl)을 DMSO에 녹인 후, 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 DOX·HCl의 몰 수의 3배만
큼 넣고 12시간 이상 교반하여, 염화수소가 제거된 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 준비했다. 0.22 mg에 해당
하는 DOX 용액을 2mg의 PEG-RSPCL 고분자가 녹여진 0.1mL의 DMSO 용액과 섞고, 이 약물-고분자 용액을 교반하면
서 4mL의 정제수를 점적하고 1시간 동안 더 교반하였다. 4℃ 수상에서 투석을 통해 DMSO와 나노입자에 봉입되지
않은 DOX를 제거하였고, 여전히 남은 미봉입 DOX는 0.45 μm 공극을 갖는 주사기용 필터를 이용하여 여과하여
제거하였다. 제조된 DOX-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX-mPEG-RSPCL1.2 나노입자는 각각 약 79 ± 15nm와 89 ±
18nm 크기를 가지며, 이들의 제타전위는 각각 1.2 ± 1.7mV와 0.3 ± 1.6mV이었다. 약물의 목표 무게함량을
10wt%으로 해서 DOX를 mPEG-RSPCL 나노입자 내부에 봉입했을 때, DOX-mPEG-RSPCL0.5 나노입자의 실제 무게함량은
5.4 ± 0.2wt%, 약물 봉입효율은 54 ± 1.8%이었고, DOX-mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 실제 무게함량은 5.2 ±
0.5wt%, 약물 봉입효율은 52 ± 5.8%이었다.
<실시예 4> 독소루비신 항암제가 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자의 항암효과[0043]
<실시예 3>으로부터 준비된 DOX·HCl 또는 DOX가 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자의 항암효과는 2,000개의 자궁경부[0044]
암세포(HeLa) 또는 5,000개의 간암세포(HepG2)를 96-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 DOX
·HCl 또는 DOX가 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자에 48시간동안 노출시켜 다양한 약물농도에서 암세포의 생존능
(cell viability)을 MTT 방법을 이용하여 평가했다. 또한, DOX·HCl 또는 DOX가 봉입된 mPEG-RSPCL 나노입자의
항암효과를 DOX·HCl 또는 DOX의 항암효과와 비교하였다.
도 8의 결과에서 보이는 바와 같이, HeLa 세포에 대한 DOX·HCl의 IC50는 약 0.93 μg/mL이었고, DOX의 IC50는[0045]
약 1.54 μg/mL이었다. DOX·HCl이 봉입된 나노입자의 경우, DOX·HCl-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX·HCl-
mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 IC50는 각각 0.47 μg/mL와 0.26 μg/mL이었고, 반면 DOX가 봉입된 DOX-mPEG-RSPCL0.5
나노입자와 DOX-mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 IC50는 실험에 사용된 범위 내에서 측정되지 않았고, 5 μg/mL 이상으
로 예상된다. 이 결과는 DOX·HCl의 항암효과에 비해 DOX·HCl-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX·HCl-mPEG-
RSPCL1.2 나노입자의 항암효과가 각각 약 2 배, 약 3.6 배 더 우수하다는 것을 의미하고, DOX의 항암효과에 비해
DOX-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX-mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 항암효과는 최소 3.2배 덜 우수하다는 것을 의미한
다.
HepG2세포에 대한 도 9의 결과는 DOX·HCl의 IC50는 약 0.57 μg/mL이었고, DOX의 IC50는 약 5.80 μg/mL이었[0046]
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다. DOX·HCl이 봉입된 나노입자의 경우, DOX·HCl-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX·HCl-mPEG-RSPCL1.2 나노입자
의 IC50는 각각 0.32 μg/mL와 0.29 μg/mL이었고, 반면 DOX가 봉입된 DOX-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX-mPEG-
RSPCL1.2 나노입자의 IC50는 DOX의 IC50와 유사했다. 이 결과는 DOX·HCl의 항암효과에 비해 DOX·HCl-mPEG-
RSPCL0.5 나노입자와 DOX·HCl-mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 항암효과가 각각 약 1.7 배, 약 2 배 더 우수하다는 것
을 나타내고, DOX의 항암효과와 DOX-mPEG-RSPCL0.5 나노입자와 DOX-mPEG-RSPCL1.2 나노입자의 항암효과는 큰 차이
가 없음을 의미한다.
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