(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(45) 공고일자 2015년02월02일
(11) 등록번호 10-1488332
(24) 등록일자 2015년01월26일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
A61K 31/56 (2006.01) A61K 36/076 (2006.01)
A61P 3/00 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2010-7022686
(22) 출원일자(국제) 2008년04월11일
심사청구일자 2013년04월04일
(85) 번역문제출일자 2010년10월11일
(65) 공개번호 10-2010-0132521
(43) 공개일자 2010년12월17일
(86) 국제출원번호 PCT/CN2008/000749
(87) 국제공개번호 WO 2009/124420
국제공개일자 2009년10월15일
(56) 선행기술조사문헌
US20040229852 A1*
Li YL, Chinese journal of modern developments
in traditional medicine, 1991, 11(2), pp.
79-82(영문 초록)*
*는 심사관에 의하여 인용된 문헌
(73) 특허권자
신파 티엔리 파머슈티컬 컴퍼니 리미티드 (
항저우)
중국 저장 항저우 유항 이코노믹 디벨로프먼트 존
홍펭 로드 넘버 599
(72) 발명자
린 항칭
대만 타이페이 시티 수에이유안 로드 넘버 49 3플
로어-2
창 추충
대만 타이페이 시티 팅저우 로드 섹션 3 레인 24
앨리 5 넘버 69 2플로어
(뒷면에 계속)
(74) 대리인
석혜선, 김용인
전체 청구항 수 : 총 13 항 심사관 : 최영희
(54) 발명의 명칭 영양분의 흡수를 증가시키는데 효과적인 약학적 조성물 및 복령 추출물
(57) 요 약
본 발명은 영양분의 흡수를 증가시키는데 다음 화학식(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 가진 라노스테
(뒷면에 계속)
대 표 도 - 도1
등록특허 10-1488332
- 1 -
인의 새로운 용도에 관한 것이다:
(I)
여기서, R1은 H 또는 CH3이고; R2는 OCOCH3, =O, 또는 OH이고; R3는 H 또는 OH이고; R4는 -C(=CH2)-C(CH3)2Ra(여기
서 Ra는 H 또는 OH), 또는 -CH=C(CH3)Rb(여기서 Rb는 CH3 또는 CH2OH)이고; R5는 H 또는 OH이고, R6는 CH3 또는
CH2OH이다.
(72) 발명자
창 원량
대만 타이페이 시티 팅저우 로드 섹션 3 레인 24
앨리 5 넘버 71 2플로어
송 이양
대만 핑퉁 카운티 핑퉁 시티 린센 로드 레인 2 넘
버 19
등록특허 10-1488332
- 2 -
특허청구의 범위
청구항 1
화학식(I)을 가진 라노스테인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물로, 여기서 상기
화학식(I)을 가진 라노스테인은
,
,
또는
인 수술을 받은 약한 환자 또는 화학요법 또는 방사선요법을
받은 암 환자의 영양분 흡수를 증가시키기 위한 약학적 조성물.
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청구항 2
삭제
청구항 3
제 1 항에 있어서,
화학식(I)을 가진 라노스테인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 0.1-20중량%로 포함하는 것인 약학적 조성
물.
청구항 4
제 1 항에 있어서,
경구로 투여되는 것인 약학적 조성물.
청구항 5
제 1 항에 있어서,
포유류는 인간인 약학적 조성물.
청구항 6
제 1 항에 있어서,
라노스테인의 원료로 복령 추출물이 사용되고, 화학식(I)을 가진 라노스테인을 1-60중량% 포함하며, 세코라노스
테인이 없는 것인 약학적 조성물.
청구항 7
제 6 항에 있어서,
상기 복령 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 약학적 조성물:
a) 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합 용매에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사 산물들, 발효 생성
물들 또는 균핵(sclerotium)을 추출하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 얻은 액체 추출물을 농축하는 단계;
c) 단계 b)로부터 얻은 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 주입하는 단계;
d) 용출액으로 96.5:3.5의 부피 비로 다이클로로메테인 및 메탄올을 함유하는 혼합 용매를 사용하여 실리카겔
컬럼을 용출하고 결과로 얻은 용출물을 수집하는 단계; 및
e) 단계 d)로부터의 용출물을 농축하는 단계.
청구항 8
제 7 항에 있어서,
단계 e)로부터의 농축 용출물은 다이클로로메테인 : 메탄올 = 96 : 4 부피 비의 혼합 용매에 의해 전개되고 자
외선 램프 및 요오드에 의해 탐지되는 실리카 박층 크로마토그래피와 일치하는 적어도 0.1의 크로마토그래피
값, Rf를 갖는 것인 약학적 조성물.
청구항 9
제 7 항에 있어서,
단계 a)의 추출은 95부피% 에탄올을 사용하여 수행되는 것인 약학적 조성물.
청구항 10
제 7 항에 있어서,
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단계 a)의 추출하는 단계는 물을 끓임으로써 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물들, 발효 생성물들 또는
균핵을 추출하는 단계; 염기를 pH 값이 9-11일 때까지 얻은 추출 수용액에 첨가하는 단계; 염기성 수용액을 회
수하는 단계; 침전물을 형성하기 위해 산을 pH 값이 4-7이 될 때까지 염기성 수용액에 첨가하는 단계; 침전물을
회수하는 단계; 침전물을 에탄올로 추출하는 단계; 및 액체 추출물을 회수하는 단계를 포함하는 것인 약학적 조
성물.
청구항 11
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 b)로부터 얻은 농축 물질은 1:1의 부피 비로 95% v/v 메탄올 수용액과 n-헥세인을 함유하는 2상 용매로 추
가로 추출되고, 메탄올 층은 2상 용매 추출 혼합물로부터 분리하고 메탄올 층은 농축되어 농축물을 형성하며,
이 농축물은 단계 c)에서 실리카겔 컬럼에 대한 원료로 사용되는 것인 약학적 조성물.
청구항 12
삭제
청구항 13
제 6 항에 있어서,
상기 복령 추출물은 화학식(I)을 가진 라노스테인을 5-35중량% 포함하는 것인 약학적 조성물.
청구항 14
삭제
청구항 15
제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,
영양분을 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
청구항 16
제 15 항에 있어서,
상기 영양분은 글루코오스, 아미노산, 비타민 또는 이의 조합인 약학적 조성물.
청구항 17
삭제
청구항 18
삭제
청구항 19
삭제
청구항 20
삭제
청구항 21
삭제
청구항 22
삭제
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명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 영양분의 흡수를 증가시키는 라노스테인 화합물들의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 유[0001]
효 성분으로서 라노스테인 화합물을 포함하는 영양분의 흡수를 증가시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
타이완 발명 특허 출원 제 92113393(공개번호 제 200425900, 2004년 12월 1일 발행)의 특허출원의 출원인은 신[0002]
체의 면역성을 강화시키는데 효과적인 약학적 조성물을 개시한다. 이 조성물은 라노스테인 화합물들의 특허 성
분들을 함유한다. 신체의 면역성을 증가시키기 위한 복령 추출물이 제공되며, 추출물의 라노스테인 화합물의 5-
60중량%를 함유하며 실질적으로 세코라노스테인이 없다. 추출물은 복령의 대사산물, 균핵 또는 발효 생성물로부
터 얻는다.
일반적으로 말해서, 영양분의 흡수는 신체를 건강하고 활력 있게 유지하는데 중요하다. 위장관에서 영양분의 완[0003]
전한 흡수는 영양분이 신체에서 여러 세포들에 의해 사용되도록 하여, 건강한 신체를 위한 강한 기초를 만든다.
예를 들어, 글루코오스는 사람 세포들에 의해 ATP(아데노신 트라이포스페이트)로 변할 수 있고, 그런 후에 세포
들은 ATP를 사용하여 심장의 고동, 신경 전달 및 골격 근육들의 작용과 같은 조직 기관들의 정상 기능들을 수행
한다. 따라서, 영양분의 흡수를 증가시키기 위한 임의의 물질들 또는 방법들에 대한 연구는 관련 분야들의 연구
자들과 일반인들에게 마찬가지로 중요한 문제가 되었다.
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 주요 목적은 영양분의 흡수를 증가시키는데 라노스테인 화합물들의 신규한 용도를 제공하는 것이다.[0004]
본 발명의 다른 목적은 영양분의 흡수를 증가시키기 위한 식품 또는 음료 첨가제들로서 라노스테인 화합물들을[0005]
사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 포함하는 영양분의 흡수를 증가시키기 위한 약[0006]
학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에서 기술된 "약학적 조성물"은 문자 그대로의 의미와 동일한 조합물을
의미할 뿐만 아니라 영양 보충 조성물들을 추가로 포함한다. 영양 보충 조성물은 영양분뿐만 아니라 영양분의
흡수를 증가시키기 위한 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 포함한다.
과제의 해결 수단
포유류(예를 들어, 인간)의 영양분의 흡수를 증가시킬 수 있는 약학적 조성물은 활성 성분으로서 다음 화학식[0007]
(I)을 가진 라노스테인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 영양분 흡수를 향상시키기 위한 유효량을 포함한
다:
[0008]
(I)[0009]
여기서, R1은 H 또는 CH3이고; R2는 OCOCH3, =O, 또는 OH이고; R3는 H 또는 OH이고; R4는 -C(=CH2)-C(CH3)2Ra(여기[0010]
서 Ra는 H 또는 OH), 또는 -CH=C(CH3)Rb(여기서 Rb는 CH3 또는 CH2OH)이고; R5는 H 또는 OH이고, R6는 CH3 또는
등록특허 10-1488332
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CH2OH이다.
바람직하게는, 라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진다:[0011]
[0012]
삭제[0013]
또는[0014]
.[0015]
바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 0.1-20중량%의 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염[0016]
을 포함한다.
바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 경구로 투여된다.[0017]
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바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 라노스테인 화합물(I)의 원료로서 복령 추출물을 포함하며, 상기 복령 추[0018]
출물은, 1-60중량%의 라노스테인 화합물(I)을 포함하며 세코라노스테인(secolanostane)이 실질적으로 없다.
바람직하게는, 상기 복령 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:[0019]
a) 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합 용매에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사 산물들, 발효 생성[0020]
물들 또는 균핵(sclerotium)을 추출하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 얻은 액체 추출물을 농축하는 단계;[0021]
c) 단계 b)로부터 얻은 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 주입하는 단계;[0022]
d) 낮은 극성을 가진 용출액으로 실리카겔 컬럼을 용출하고 결과로 얻은 용출물을 수집하는 단계; 및[0023]
e) 단계 d)로부터의 용출물을 농축하는 단계.[0024]
바람직하게는, 단계 e)로부터의 농축 용출물은 다이클로로메테인 : 메탄올 = 96 : 4의 혼합 용매에 의해 전개되[0025]
고 자외선 램프 및 요오드에 의해 탐지되는 실리카 박층 크로마토그래피와 일치하는 적어도 0.1의 크로마토그래
피 값, Rf를 가진다.
바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 95% 에탄올을 사용하여 수행된다.[0026]
바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 물을 끓임으로써 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물들, 발효[0027]
생성물들 또는 균핵을 추출하는 단계; 염기를 pH 값이 9-11일 때까지 얻은 추출 수용액에 첨가하는 단계; 염기
성 수용액을 회수하는 단계; 침전물을 형성하기 위해 산을 pH 값이 4-7이 될 때까지 염기성 수용액에 첨가하는
단계; 침전물을 회수하는 단계; 침전물을 에탄올로 추출하는 단계; 및 액체 추출물을 회수하는 단계를
포함한다.
바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 농축 물질은 1:1의 부피 비로 95% v/v 메탄올 수용액과 n-헥세인을 함유하는[0028]
2상 용매로 추가로 추출되고, 메탄올 층은 2상 용매 추출 혼합물로부터 분리하고 메탄올 층은 농축되어 농축물
을 형성하며, 이 농축물은 단계 c)에서 실리카겔 컬럼에 대한 원료로 사용된다.
바람직하게는, 단계 d)의 낮은 극성의 용출물은 96.5:3.5의 부피 비로 다이클로로메테인 및 메탄올을 함유하는[0029]
혼합 용매이다.
바람직하게는, 상기 복령 추출물은 5-35중량%의 라노스테인 화합물(I)을 포함한다.[0030]
바람직하게는, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 글루코오스, 아미노산, 비타민 또는 이의 조합인 영양분을 더[0031]
포함한다.
본 발명에서, 화학식(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 가진 라노스테인 또는 활성 성분으로서 영양분[0032]
의 흡수를 증가시키는데 사용하기 위한 상기 복령 추출물은 다음 상황에서 사용될 수 있다: (1) 노인들의 영양
상태를 높이기 위한 경우; 노인들의 소화 시스템은 노화와 함께 기능이 감소하기 때문에, 그 결과 영양분의 흡
수가 저하되어, 노인들의 영양결핍을 일으킨다; 활성 성분의 사용이 노인들의 영양상태를 끌어올리는 것을 돕는
다. (2) 허약한 어린이들을 강하게 하는 경우, 일부 어린이들은 선천적으로 평균보다 약하고 영양 보충제들만을
증가시킴으로써 체격이 증가될 수 없어서, 활성 성분의 사용이 영양학적으로 불리한 어린이를 강하게 하는 것을
도울 수 있다. (3) 계속 스트레스를 받거나 주로 야근하는 사람들의 경우; 이런 사람들은 스트레스에 의해 유발
된 이상들 때문에 위장 문제들을 주로 겪으며, 위장 문제들 중 하나는 흡수 불량 증후군이며, 이것이 피곤과 낮
은 에너지와 같은 다른 문제들을 일으킬 수 있고, 따라서 활성 성분의 사용이 이런 문제들을 완화하는 것을 도
울 수 있다. (4) 많은 작업량을 처리하기 위해 다량의 에너지를 사용하고 영양 보충이 빈번하게 필요한 운동선
수, 노동자 및 사무원의 경우; 과도하게 일하거나 노동하는 사람은 다량의 에너지(ATP 형태)를 사용하는 것이
필요하며 자주 에너지를 보충해야 한다; 에너지는 신체에서 글루코오스로부터 주로 유도되며, 글루코오스의 보
충이 빨라지면 에너지의 생산을 촉진시켜 활성 성분의 사용은 자기 성과를 높이기 원하는 운동선수, 노동자 및
작업자를 위해 글루코오스를 보충하기 위한 효과적인 방법일 것이다. (5) 수술 또는 암 치료(화학요법 또는 방
사선요법)를 받고 영양 보충제(아미노산, 글루코오스 및 비타민 포함)가 급하게 필요한 신체적으로 약한 환자들
의 경우; 활성 성분의 흡수가 환자들을 빠르게 회복시키는 것을 도울 수 있다. (6) 바이러스성 설사로 고생하는
사람들의 경우; 어린이들은 환절기 동안 바이러스 감염(예를 들어 로타바이러스의 감염)에 의해 유발된 독감과
설사에 종종 걸리기 쉽게 되며, 심한 경우에, 설사는 수분, 전해질, 영양분의 심각한 손실을 일으켜 사망에 이
를 수도 있다; 본 발명의 활성 성분은 (바이러스들을 제거하는) 면역원성을 높이는 것으로 알려져 왔고 영양분
등록특허 10-1488332
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의 흡수를 증가시킬 수 있기 때문에, 활성 성분의 흡수는 (삼투압을 변화시키는) 영양분의 흡수와 함께 물이 흡
수되어 신체로 들어가서, 고생하는 어린이들을 생명을 위협하는 설사로부터 보호할 수 있다. 요약하면, 본 발명
의 활성 성분은 영양 보충제로서 사용될 수 있고 분유, 음료 및 식품에 첨가될 수 있다; 본 발명의 활성 성분은
의료 목적으로 사용될 수 있고 정제, 캡슐, 과립 투약, 액체 투약 및 주사 투약의 형태로 활성 성분을 위한 약
학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제의 혼합물에 의약으로 사용될 수 있다.
발명의 효과
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음[0033]
도면의 간단한 설명
도 1 내지 3은 본 발명의 라노스테인 화합물 K2, K3 및 K4가 장 세포들(Caco-2)에 의한 글루코오스의 흡수에 미[0034]
치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4 내지 7은 본 발명의 라노스테인 화합물 K1, K2, K3 및 K가 장 세포들(Caco-2)에 의한 아르기닌의 흡수에
미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8 내지 10은 본 발명의 라노스테인 화합물 K1, K3 및 K4가 장 세포들(Caco-2)에 의한 트립토판의 흡수에 미
치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11 내지 14는 본 발명의 라노스테인 화합물 K1, K2, K3 및 K4가 장 세포들(Caco-2)에 의한 폴산의 흡수에 미
치는 효과를 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
현대 생화학은 인간은 식품으로부터 다양한 영양분을 얻을 수 있다는 것을 밝혀내었고, 에너지를 발생시키거나[0035]
세포 신진대사 활동을 유지하는데 주로 필요한 영양분은 글루코오스, 아미노산 및 비타민을 포함한다. 그러나,
이런 영양분은 인간 조직들 또는 세포들을 자유롭게 출입할 수 없으나, 대신 다른 메커니즘들에 의해 엄격하게
조절된다. 이 현상은 화학물질들(예를 들어, 의약들)이 신체에 흡수되는 상황과 다른데, 화학물질들은 농도 차
를 기초로 하여 확산을 통해 신체를 출입한다. 그러나 영양분이 세포를 출입할 때, 영양분은 특정 운반체 단백
질 또는 세포막에 위치한 채널에 의해 출입해야 한다. 연구 케이스가 아래 제공되며, 인간 장에서 글루코오스
흡수의 과정이 기술된다.
먼저, 장에 있는 운반체 단백질들은 나트륨 이온들과 결합하여, 운반체 단백질들이 구조적으로 변형되고, 뒤이[0036]
어 글루코오스를 결합하기 위한 부분을 개방한다. 글루코오스와 나트륨 이온들과 운반체 단백질들의 공동의 조
합은 운반체 단백질의 형태적 변화를 유도하여, 글루코오스와 나트륨 이온들이 결과적으로 (세포 내부와 대면하
는) 세포에 들어갈 수 있다. 나트륨 이온이 먼저 분리되어 세포에 들어가서, 글루코오스와 관련 운반체 단백질
이 불안정하게 한다. 마지막으로, 글루코오스가 분리되어 세포에 들어가고, 새롭게 글루코오스와 나트륨 이온들
이 없는 운반체 단백질은 원래 방향으로 돌아가서 장과 대면한다. 세포에서 글루코오스의 양이 특정 수준으로
쌓일 때, 다른 형태의 운반체 단백질이 글루코오스가 장 세포들을 빠져나와 농도 기울기를 통해 혈관에 들어가
게 하는데 사용되며 이런 형태의 운반체 단백질이 촉진된 확산 단백질들에 속한다.
Caco2 세포는 신체 결장 암으로부터 유도된 세포주이고; 이 세포주의 주요 특징은 세포들이 자동으로 그리고 빠[0037]
르게 인간 장관과 유사한 극성을 가진 세포 단층들로 분리될 수 있다는 것이다. 세포 배양의 2 내지 3주 후,
Caco2 세포들은 높은 가수분해 능력을 갖는 미소용모(brush borders)와 치밀이음부(tight junctions)로 나뉠
것이고, 특정 물질들을 봉쇄하고 통과하게 할 수 있는 세포 단층들을 형성할 것이다. Caco2로 이루어진 세포 단
층들은 장관과 유사한 전기 저항값을 가지며 대략 300Ωcm
2
이다. 또한, Caco2 세포 단층들은 아미노산, 글루코
오스 및 비타민을 위한 운반체 단백질을 포함하는 다양한 영양분에 해당하는 운반체 단백질을 소유하는 것으로
입증되었다. 따라서, Caco2 세포 단층들은 주로 장 세포들에서 의약들 또는 영양분의 처리를 포함하는 연구 또
는 시험에서 주로 사용되고 이후 결과들은 인간 장 세포들에 의한 의약들 또는 영양분의 흡수를 설명하는데 사
용되며, 관련 분야에 익숙한 사람들에 의해 쉽게 받아들여진다[Hidalgo IJ, al., Gastroenterology,
1989;96:736-749.; Artursson P., J Pharm Sci, 1990;79:476-482.].
전통적으로, 중국 의사들이 특히 약한 어린이, 고령으로 약해진 노인들 또는 병 또는 질환(예를 들어, 암)에 의[0038]
해 약해진 환자들을 치료할 때, 의사들은 주로 상기 환자들을 개선하거나 치료하는데 유효한 중국 의약을 사용
등록특허 10-1488332
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하여, 이런 사람들을 건강한 상태로 되돌리는 것을 목표로 한다. 그러나, 유효한 중국 의약들이 사람의 건강을
개선하는 방식들은 잘 알려져 있지 않고; 이 방식들은 의약들이 필수 영양분을 갖기 때문에 효과가 있거나 영양
분의 흡수를 증가시키기 때문에 효과가 있거나 의약들이 상기 두 태양을 통해 개인의 건강을 향상시킬 수 있다
는 것이다. 영양분의 흡수가 흡수의 매커니즘을 촉진시켜 증가하는 경우, 어떤 성분들이 운반체 단백질들에 영
향을 미치는데 효과가 있는지 아직 명확하지 않고 관련된 과학적 증거가 지금까지 발견되지 않았다. 따라서, 영
양분의 흡수를 증가시키는 중국 의약들의 유효 추출물 및/또는 중국 의약들의 유효 성분들의 효과를 발견하기
위해서, 영양분의 흡수를 검사하기 위해 상기 Caco2 세포들을 사용하는 것이 제안되었다. 본 발명의 발명자가
Caco2 세포들에 대해 검사될 전형적인 유효한 중국 의약들(인삼 및 황기)를 선택할 때; 비전형적인 유효한 중국
의약인 복령도 검사하였고 복령의 추출물과 이의 라노스테인 화합물들이 Caco2 세포들에 의한 영양분의 흡수를
증가시키는데 효과적이라는 것을 예상 밖으로 발견하였다.
본 발명에 개시된 포유류들(예를 들어, 인간)에 의한 영양분 흡수를 향상시키는 복령의 추출물은 미정제 추출물[0039]
을 얻기 위한 종래의 추출 방법에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)을 추출하는 단계, 크로마토그래피에 의
해 미정제 추출물을 낮은 극성 부분의 라노스테인(96:4의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로) 및 높은 극성
부분의 세코라노세테인(90:10 및 0:100의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로)으로 분리하는 단계를 포함하
는, US2004/0229852A1에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있고, 라노스테인 부분은, 다이클로로메테
인:메탄올 = 96:4의 혼합 용매에 의해 전개될 때, 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진 박층 크로마토그
래피에 의해 탐지되며, Rf는 세코라노스테인 부분의 경우 0.1 미만이다. 여러 라노스테인은 라노스테인 부분을
실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출시킴으로써 라노스테인 부분과 분리되며, 사용된 용출액은 97:3 내지
95:5이다.
다음 실시예들은 본 발명을 더욱 상세하게 기술하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않[0040]
아야 한다.
실시예 1:[0041]
복령 분말은 30kg의 중국산 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로 제조하였다. 복령 분말을 24시간 동안 120L[0042]
95% 알콜로 추출하였다. 혼합물을 여과하여 여과물을 얻었다. 잔류물을 추가 3 사이클 동안 추출하고 여과하였
다. 여과물들을 혼합하고 농축하여 265.2g의 건조 분말을 얻었다. 건조 추출물을 2상 추출제(n-헥세인: 95% 메
탄올 = 1:1)로 분배 추출하였고 메탄올 층을 제거하고, 농축하여 246.9g의 건조 고체를 얻었다. 건조 고체의 분
리는 건조 고체의 중량의 10-40배 실리카겔을 채운 실리카겔 컬럼에 의해 수행하였다. 70-230 메쉬의 지름을 가
진 실리카겔은 머크사에 의해 제조되었고 실리카겔 60의 기호를 가진다. 컬럼은 다음 용출액:
다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액; 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10의 혼합 용액 및 순수 메탄올로
용출되었다. 용출액들은 박층 크로마토그래피(TLC)로 검사하였고, 자외선 램프와 요오드 증기가 탐지를 위해 사
용되었고 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액은 전개액으로 사용되었다. TLC에서 유사한 구성물질을
가진 용출액들을 혼합하였다.
용출은 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액으로 수행하여 78g의 양으로 PCM 부분을 얻었다. PCM은 박[0043]
층 크로마토그래피에서 6개 추적점(trace points)을 나타내었다. 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10 및 순수 에
탄올의 용출액으로 수행된 용출로부터 얻은 용출액들을 혼합하여 168g의 PCW 부분을 얻었다.
PCM 부분은 다이클로로메테인:메탄올 = 96.5:3.5의 용출액과 동일한 실리카겔 컬럼에 의해 추가로 분리되어[0044]
K1(K1-1 및 K1-2), K2(K2-1 및 K2-2), K3, K4, K4a, K4b, K5, K6a 및 K6b의 정제된 라노스테인 성분들을 얻었
다. 분리 단계와 확인 분석 데이터의 추가 상세내용은 US2004/0229852 A1에서 발견할 수 있다.
상기 K1 내지 K6b 화합물은 다음 구조를 가진다:[0045]
[0046]
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- 10 -
K1-1:R2 = OCOCH3(파침산) K1-2:R2 = OCOCH3(소량)[0047]
K2-1:R2 = OH(투물로스산) (디하이드로파침산)[0048]
K2-2:R2 = OH(소량)[0049]
(디하이드로투물로스산)[0050]
[0051]
K3:R6 = CH3, R5 = H K4:R2 = α-OH, R5 = H[0052]
(폴리포렌산 C) (3-에피디하이드로투물로스산)[0053]
K4a:R6 = CH2OH, R5 = H K4b:R2 = β-OCOCH3, R5 = OH[0054]
K6a: R6 = CH3, R5 = OH[0055]
[0056]
K6b K5[0057]
PCM 부분으로부터 분리된 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b의 양은 아래 표에 나열된다. PCM 부분은 대략 15중량%[0058]
의 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b를 함유한다.
표 1
K1[0059] K2 K3 K4 K4a K4b K5 K6a K6b
3.0g 6.2g 1.93g 0.55g 66mg 86.8mg 47.6mg 21.4mg 90.7mg
실시예 2:[0060]
영양분 흡수를 증가시키는데 본 발명의 실시예 1에서 제조된 라노스테인 화합물들 K1, K2, K3 및 K4, 및 PCM 추[0061]
출물의 효과들은 다음 방법들에 의해 평가되었다.
인간 Caco2 세포들의 배양과 영양분 흡수의 검사[0062]
실시예의 라노스테인 화합물들 또는 PCM 추출물은 검사에서 Caco2 세포들에 의한 글루코오스, 아미노산 및 비타[0063]
민과 같은 영양분의 흡수를 증가시키는 것으로 나타났고, Caco2 세포들은 폴리카보네이트 멤브레인 트렌스웰
®
인서트(No. 3414, 미국, 뉴욕, 코닝) 상에 주입하였고 세포 배지를 2-3일 마다 1회 교체하였다; 14-21일 후
Caco2 세포들을 단층들로 나누었다. 그 후, 단층들의 경상피전기저항(TEER)을 Milicell
®
-ERS(Millipore EVOM-
6; World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA)를 사용하여 측정하였고, TEER이 300 ~ 450Ωcm
2
에 도달하
고, Caco2 세포들이 분할된 미소용모의 형태를 가질 때, Caco2 세포들은 영양분 흡수를 검사하기 위한 준비가
되었다. Caco2 세포 단층들은 2일 동안 검사될 영양분의 다른 성분을 가진 세포 배지로 배양하였고, 사용된 혈
등록특허 10-1488332
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청은 목탄-덱스트란(CD-FBS)으로 처리된 태아 소 혈청이었다. 2일 배양 후, 세포 배양액을 PBS로 세척하고 대신
에 검사될 영양분을 함유하지 않는 버퍼(예를 들어, 글루코오스 흡수가 검사될 때, 글루코오스를 함유하지 않는
버퍼들을 사용하였다)로 1시간 동안 배양하였고, Caco2 세포 단층들을 통과하는 영양분 분자들의 비율을 추적하
기 위해서, 버퍼를 방사능표지화된 특정 영양분의 소정의 농도를 가진 새로운 버퍼로 대체하였다. 방사능표지화
된 영양분은 [
14
C]-D-글루코오스 또는 [
14
C]-D-2-데옥시글루코오스, [
3
H]-L-아르기닌, [
3
H]-L-트립토판, 및 [
3
H]-
폴산을 포함하였다. 또한, 탄소-14 또는 산소-3로 방사능표지화된 D-자일리톨의 측정은 Caco2 세포 단층들의 무
결성을 확보하는 수단이었다[참조: Artursson, P., J Pharm Sci, 1990, 79: 476-482; Ferraris RP, et al., Am
J Physiol, 1993, 264: G285-G293].
글루코오스 흡수의 분석[0064]
인간 Caco2 세포들을 트랜스월 인서트 상에 주입하여 완전한 단층들로 나뉘게 하였다. 실제 측정 전에, 세포 단[0065]
층들을 검사할 영양분으로 2일 동안 처리하고 글루코오스 없이 1시간 동안 (80 mM NaCl, 100 mM 만니톨, 20 mM
Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA의 조성물을 가진) 버퍼로 배양하였고, 상부 세포층들
에 있는 버퍼를 10mM 글루코오스의 최종 농도를 가진 새로운 버퍼로 뒤이어 대체하였고, 탄소-14로 방사능표지
화된 D-글루코오스 또는 D-데옥시글루코오스(60mCi/mmol, American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO,
USA)의 2μCi/mL이 포함되었고, 그 결과 Caco2 세포 단층들을 통과하는 글루코오스 분자들의 속도를 추적할 수
있었다. 10μL의 버퍼를 특정한 시간 간격으로 하부 세포층들로부터 추출하여 이의 방사능활성 강도를 측정하였
다; 방사능활성 강도의 값은 글루코오스 농도의 값으로 바뀌며, 특정 시간 간격에서 하부 세포층들 버퍼의 글루
코오스 분자 농도를 나타낸다. TEER 값을 측정하는 것 이외에, 검사는 Caco2 세포 단층들의 완결성을 측정하기
위해 탄소-14로 방사능표지화된 D-자일리톨의 수준뿐만 아니라 글루코오스 수송체들을 통해 흡수되지 않은 글루
코오스를 나타낸 비-특이적 배경 값을 측정하기 위해 탄소-14로 방사능표지화된 L-글루코오스의 수준을 동시에
측정하였다. 방사능활성 강도의 값은 특정 시간 간격에서 Caco2 세포 단층들을 통과하는 하부 세포층들의 글루
코오스 분자들의 농도를 나타내는 값으로 바뀔 수 있다. 그래프는 다른 시간 간격으로 하부 세포층들의 글루코
오스 농도를 기초로 하여 그려졌고, 직선은 수치 분석 방법을 사용하여 얻어졌고, 직선은 세포 단층들이 상기
농도를 가진 영양분으로 처리되었을 때, Caco2 세포 단층들을 통과하는 글루코오스 분자들의 평균 속도를 나타
내는 기울기를 가졌다. 이 검사에서 대조군에 대한 데이터는 검사될 영양분으로 처리되지 않은 세포 단층들을
사용하여 얻을 수 있다. 측정을 위한 상기 방법들은 다음 참조문헌을 주로 기초로 한다: Kimura T. et al., J.
Pharm. Pharmacol., 2001, 54, 213-219.
아미노산 흡수 분석[0066]
아르기닌과 트립토판과 같은 아미노산들의 흡수를 검사하는 것에 관해서, Caco2 세포 단층들을 2일 동안 검사될[0067]
영양분의 다른 농도를 함유하는 세포 배지로 배양하였고 PBS로 세척하고 상기 아미노산을 함유하지 않는 버퍼
(아르기닌을 검사하기 위한 조성물은 : 137 mM NaCl, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.3 mMNaH2PO4, 0.3 mM K2HPO4, 5.4
mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 및 10 mM 글루코오스였고 트립토판 흡수를 검사하기 위한 조성물은 137 mM 염
화 콜린, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.6 mM KH2PO4, 5.4 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 및 10 mM 글루코오스였
다)로 대신 배양하였다. 배양 1시간 후, 수소-3으로 방사능표지화된 아미노산(L-
3
H 아미노산)을 사용하여 아미
노산의 흡수에 대해 미친 영양분의 다른 농도로 Caco2 세포 단층들을 처리하는 영향을 관찰하는데 사용하였다.
TEER을 측정하는 것 이외에, 검사는 Caco2 세포 단층들의 완결성을 확보하기 위해 수소-3으로 방사능표지화된
D-자일리톨의 수준을 측정하였다. 방사능활성 강도의 값은 특정 시간 간격에서 Caco2 세포 단층들을 통과하는
하부 세포층들의 아미노산 분자들의 농도를 나타내는 값으로 바뀔 수 있다. 그래프는 다른 시간 간격으로 하부
세포층들의 아미노산 농도를 기초로 하여 그려졌고, 직선은 수치 분석 방법을 사용하여 얻어졌고, 직선은 세포
단층들이 상기 농도를 가진 영양분으로 처리되었을 때, Caco2 세포 단층들을 통과하는 아미노산 분자들의 평균
속도를 나타내는 기울기를 가졌다. 이 검사에서 대조군에 대한 데이터는 검사될 영양분으로 처리되지 않은 세포
단층들을 사용하여 얻을 수 있다. 측정을 위한 상기 방법들은 다음 참조문헌을 주로 기초로 한다: Pan M., et
al., Am J Physiol. Gastrointest Liver Physiol 1995, 268: G578-G585.
폴산 흡수 분석[0068]
10-cm 배양 접시 상에 인간 Caco2 세포들을 주입하고, 측정을 진행하기 전에 분할 과정이 완료되도록 2주 동안[0069]
기다린다. 측정을 수행하기 전에, 세포들을 2일 동안 다른 농도의 영양분으로 먼저 처리한 후 1시간 동안 폴산
등록특허 10-1488332
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없는 버퍼(폴산염 운반 배양 버퍼(pH 6.0): 0.14 g/L CaCl2, 0.1 g/L MgCl2, 및 0.1 g/L MgSO4로 보충된 한스
블랜스드 염 용액(HBSS))로 배양하고 뒤이어 5μM 폴산의 최종 농도를 가진 새로운 버퍼로 대체하며, 여기에 수
소-3으로 방사능표지화된 2μCi/mL의 폴산(3,5,7,9-
3
H-폴산, 25 mCi/mmol, ARC, St. Louis, MO, USA)이 포함된
다. 그 후, 세포들을 특정 시간 간격으로 PBS로 세척하고, 용해하고 원심분리하기 위해 수집되기 전에 0.2mL의
0.2N NaOH로 터트려 개방한다. 최종 상청액의 고정량을 단백질 농도를 측정하기 위해 추출하였고, 20μL의 상청
액을 Caco2 세포들 속으로 흡수되고 축적된 폴산 분자들의 농도를 측정하기 위해 추출하였다. 계산된 값은 다른
특정 시간 간격으로 동일한 단백질 질량을 가진 Caco2 세포들의 세포액에서 폴산 분자들의 농도를 나타내었다.
그래프는 다른 시간 간격으로 하부 세포층들의 폴산 농도를 기초로 하여 그려졌고, 직선은 수치 분석 방법을 사
용하여 얻어졌고, 직선은 세포 단층들이 상기 농도를 가진 영양분으로 처리되었을 때, Caco2 세포 단층들을 통
과하는 폴산 분자들의 평균 속도를 나타내는 기울기를 가졌다. 이 검사에서 대조군에 대한 데이터는 검사될 영
양분으로 처리되지 않은 세포 단층들을 사용하여 얻을 수 있다. 측정을 위한 상기 방법들은 다음 참조문헌을 주
로 기초로 한다: Dudeja PK., et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physi , 2001, 281(1): G54 - G60.
결과[0070]
(1) Caco2 세포들에 의한 2-데옥시글루코오스의 흡수를 증가시키는데 실시예 1에서 제조된 PCM 추출물의 효과는[0071]
표 2에 도시된다. 표 2는 PCM 추출물은 낮은 복용량(0.0033㎍/cc)으로 2-데옥시글루코오스의 흡수를 증가시키는
데 매우 효과적이라는 것을 도시한다.
표 2
Caco2 세포에 의한 2-데옥시글루코오스의 흡수에 대한 PCM 추출물 효과[0072]
수송 속도
(nmol/min)
백분율
(%)
대조군 4.7±0.29 100.00
PCM, 0.033㎍/cc
* 5.35±0.41 113.74
PCM, 0.0033㎍/cc
* 7.61±0.56 161.57
실시예 1에서 제조된 PCM 추출물이 0.033㎍/cc(PCM1)과 0.0033㎍/cc(PCM2)의 라노스테인 화합물들의 농도를 갖[0073]
도록 조절하였다.
(2) Caco2 세포들에 의한 글루코오스의 흡수에 대한 실시예 1에서 제조한 라노스테인 화합물 K1, K2, K3 및 K4[0074]
의 효과는 표 3 및 도 1 내지 3에 도시된다. 표 3은 낮은 복용량(1μM - 0.001μM)에서, 라노스테인 화합물 K1,
K2, K3 및 K4은 Caco2 세포들에 의한 글루코오스 흡수를 증가시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 도 1 및 3
은 라노스테인 화합물 K2 및 K4는 글루코오스 흡수를 증가시키는데 효과적이고, 흡수 속도는 시간과 선형관계를
가진다. 선형관계는 복령의 성분들이 관련 운반체 단백질에 영향을 주거나 증가시킴으로써 글루코오스 흡수를
증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 비록 라노스테인 화합물 K1은 효과적인 것으로 보이지 않으나, K1은 K2의
전구약물이고, K2로 쉽게 변형될 수 있고 장 또는 혈액에서 효과적이게 된다.
표 3
Caco2 세포들에 의한 글루코오스의 흡수에 대한 라노스테인 화합물들의 효과들[0075]
화합물
1
(μM)
운반 속도
2
(nmol/min)
백분율(%) 효과
대조군 3.0420±0.0605 100.00 -
K2
0.001 3.9220±0.0388 128.93 ↑
0.01 4.1350±0.0688 135.93 ↑
0.1 3.0860±0.1104 101.45 -
1.0 2.9690±0.0974 97.60 -
등록특허 10-1488332
- 13 -
K3
0.001 2.6170±0.1982 86.03 -
0.01 3.5970±0.1285 118.24 ↑
0.1 3.4030±0.1794 111.87 ↑
1.0 3.3490±0.1940 110.09 ↑
K4
0.001 3.7320±0.1447 122.68 ↑
0.01 4.1730±0.0989 137.18 ↑
0.1 4.7450±0.1745 155.98 ↑
1.0 3.9740±0.2231 130.64 ↑
1. 결과는 평균±SD(n=3)으로 도시된다.[0076]
(3) Caco2 세포들에 의한 아미노산(아르기닌과 트립토판)의 흡수에 대한 실시예 1에서 제조한 라노스테인 화합[0077]
물 K1, K2, K3 및 K4의 효과는 표 4와 5 및 도 4 내지 10에 도시된다. 표 4는 낮은 복용량(1μM - 0.001μM)에
서, 라노스테인 화합물 K1, K2, K3 및 K4은 Caco2 세포들에 의한 아르기닌 흡수를 증가시키는데 효과적이라는
것을 나타낸다. 표 5는 낮은 복용량(1μM - 0.001μM)에서, K1, K3 및 K4은 Caco2 세포들에 의한 트립토판 흡수
를 증가시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 더욱 중요하게는, Caco2 세포들에 의한 상기 아미노산의 흡수는
라노스테인 화합물(1μM - 0.001μM)의 낮은 복용량에 의해 증가될 것으로 보여지며, 흡수 속도는 도 4 내지 10
에서 볼 수 있듯이, 시간과 선형관계를 가진다. 선형관계는 라노스테인 화합물들이 관련 운반체 단백질에 영향
을 주거나 증가시킴으로써 상기 아미노산의 흡수를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
표 4
Caco2 세포들에 의한 아르기닌의 흡수에 대한 라노스테인 화합물들 K1, K2, K3 및 K4의 효과들[0078]
화합물
(μM)
운반 속도
1
(nmol/min)
백분율(%) 효과
대조군 6.1390±0.6935 100.00 -
K1
0.001 8.5490±0.6102 139.26 ↑
0.1 7.1640±0.3526 113.27 ↑
1.0 7.8920±0.5695 128.56 ↑
K2
0.001 8.4400±2.3890 137.48 ↑
0.1 8.7740±2.7020 142.92 ↑
1.0 8.5550±1.3090 139.35 ↑
K3
0.001 7.6100±0.3255 123.96 ↑
0.1 9.0900±0.9357 148.07 ↑
1.0 6.9050±0.0814 112.48 ↑
K4
0.001 9.7980±0.0843 159.60 ↑
0.1 7.6420±1.3290 124.48 ↑
1.0 6.8730±1.0980 111.96 ↑
1. 결과는 평균±SD(n=3)으로 도시된다.[0079]
표 5
Caco2 세포들에 의한 트립토판의 흡수에 대한 라노스테인 화합물들 K1, K3 및 K4의 효과들[0080]
화합물
1
(μM)
운반 속도
2
(nmol/min)
백분율(%) 효과
대조군 17.780±0.501 100.00 -
K1
0.001 23.550±1.304 132.45 ↑
0.01 24.160±1.063 135.88 ↑
1.0 21.390±0.886 120.30 ↑
K3
0.001 21.520±1.298 121.03 ↑
0.01 24.220±2.257 136.22 ↑
1.0 21.610±2.419 121.54 ↑
등록특허 10-1488332
- 14 -
K4
0.001 15.720±2.575 88.41 ↓
0.01 27.390±1.818 154.05 ↑
1.0 27.200±1.370 152.98 ↑
1. K2는 Caco2 세포들에 의한 트립토판의 흡수에 대해 충분한 효과를 갖지 않는다.[0081]
2. 결과는 평균±SD(n=3)으로 도시된다.[0082]
(4) Caco2 세포들에 의한 폴산의 흡수에 대한 실시예 1에서 제조한 라노스테인 화합물 K1, K2, K3 및 K4의 효과[0083]
는 표 6 및 도 11 내지 14에 도시된다. 표 6은 낮은 복용량(1μM - 0.001μM)에서, K1, K2, K3 및 K4은 Caco2
세포들에 의한 폴산 흡수를 증가시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 더욱 중요하게는, Caco2 세포들에 의한
상기 폴산의 흡수는 라노스테인 화합물(1μM - 0.001μM)의 낮은 복용량에 의해 증가될 것으로 보여지며, 흡수
속도는 도 11 내지 14에서 볼 수 있듯이, 시간과 선형관계를 가진다. 선형관계는 라노스테인 화합물들이 관련
운반체 단백질에 영향을 주거나 증가시킴으로써 상기 폴산의 흡수를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
표 6
Caco2 세포들에 의한 폴산의 흡수에 대한 라노스테인 화합물들 K1, K2, K3 및 K4의 효과들[0084]
화합물(μM) 운반 속도1
(nmol/mg/min)
백분율(%) 효과
대조군 0.0759±0.0169 100.00 -
K1 0.001 0.1105±0.0157 145.59 ↑
0.1 0.1042±0.0153 137.29 ↑
K2 0.001 0.1094±0.0194 144.14 ↑
0.1 0.1083±0.0280 142.69 ↑
K3 0.001 0.0864±0.0157 113.83 ↑
0.1 0.0852±0.0174 112.25 ↑
K3 0.001 0.0665±0.0126 87.62 -
0.1 0.0852±0.0174 112.25 ↑
1. 결과는 평균±SD(n=3)으로 도시된다.[0085]
실시예 3:[0086]
100kg의 복령을 3시간 동안 800kg의 물로 끓인 후 50℃로 냉각시키기 위해 방치하고 이의 pH 값을 5N NaOH 용액[0087]
을 사용하여 pH 11로 조절하고 결과로 얻은 용액을 3시간 동안 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 액체를 고체
로부터 분리하고 800kg의 물을 분리된 고체에 첨가하였다. 상기 절차를 반복하였고, 절차는 pH 값을 NaOH로 pH
11로 조절하는 단계, 교반하는 단계 및 원심분리로 고체를 제거하는 단계를 포함하였다. 두 개의 결과로 얻은
액체를 혼합하고 50℃에서 100kg의 용액으로 진공 농축하였고 pH 값을 3N HCl를 사용하여 pH 6.5로 조절하여 침
전물을 생성하였다. 상기 침전물을 용액으로부터 분리하고, 뒤이어 40L H2O로 세척하고 원심분리하여 침전물을
얻었다; 침전물을 8L의 물로 분사 건조하여 380g의 분말을 얻었다. 그 후, 분말을 4L의 알콜을 사용하여 3회 추
출하였고 추출 용액들을 혼합하고 농축하여 238.9g의 알콜 추출물을 얻었다. 그런 후에 추출물을 HPLC
분리하여, 추출물의 그램당 185.93mg의 K2, 20.34mg의 K3, 4.52mg의 K1을 나타내었다. 다시 말하면, 추출물의
각 그램은 대략 226.07mg의 라노스테인 화합물을 가진다.
실시예 4:[0088]
실시예 1에서 제조된 PCM 부분을 가진 캡슐들은 다음 조성물을 기초로 제조하였다:[0089]
표 7
성분들[0090] 캡슐 당 30,000 캡슐 당
실시예 1에서 제조된 PCM(대략 15중량%의 K1-K6
화합물 함유)
11.2mg 336.0g
소듐 실리코알루미네이트 5.0mg 150.0g
감자 전분 378.8mg 11,364.0g
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마그네슘 스테아레이트 5.0mg 150.0g
전체 400mg 12,000.0g
PCM 부분 및 소듐 실리코알루미네이트는 #80 메쉬를 사용하여 걸러내었고 감자 전분은 #60 메쉬를 사용하여 걸[0091]
러내었고 마그네슘 스테아레이트는 #40 메쉬를 사용하여 걸러내었다. 뒤이어, 상기 성분들을 혼합기에 골고루
혼합하고 결과로 얻은 혼합물을 No. 1 빈 캡슐에 채웠다. 각 캡슐은 대략 1.68mg(0.42중량%)의 유효 성분 K1-K6
를 함유한다.
도면
도면1
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